※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之铭言： : ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之铭言： : : 讲仔细一点我们的构想 : : 我们想研究一个蛋白质两个 domain 的互相影响 : : 目前这个蛋白质已经有结构 (X ray) : : 我们想看这两个 domain 在动态下的结构改变 : : 尤其是看其两个 domain 如何细微的藉由结构的改变而调控彼此 : : 两个 domain 分别为 15 kDa 与 30 kDa : : 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling : : 而 30 kDa 的部分不没有 labelling : : 分别纯化出来 看能不能再结合为 full length protein : : 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的结构改变 : : 这个实验设计为最大的盲点就在如何使两个 domain 再结合回去 : : 已知这两个domain 中间有一个 linker 的部位 : : 但是如何能专一性的将这两个 domain 的 N端 与 C端接在一起就是个大挑战 : : 因此 fusion 的办法似乎是不可行 : : 所以在想有没有其他方式可以结合这两者 : : DNA 具有 DNA ligase 可以结合 DNA 的 3' 与 5' : : 蛋白质好像就没听说过可以有 enzyme 结合 N 端与 C 端 : : ubiquitin 结合的机制好像也不适用 : : 化学 cross link 的方法会卡在蛋白质表面胺基酸的 side chain : : 也会任意的键结在一起 : : 有没有知道其他方式可以做的阿 : : 还是这本身就是个很难的题目?... : 嗯 那如果这样呢 : 把两个蛋白质的C-ter与N-ter接上一小段nucleotide : 然後再用DNA ligase接起来.... : 不然就把23S rRNA的 aminoacyl-transferase活性拿出来用 如果可以的话 good idea 但是这有一个问题 (因为这方法我想过) 即便是两各蛋白质成功接上DNA or RNA 再是利用ligase把他接在一起我认为可能性不高 1. DNA 或 RNA 不能过长 太长两个 domain 就没法子回覆一起 整各实验就没意义了 2. 太短 ligase 要接合两段 DNA 或 RNA 中间不能有立体障碍的 但是两各蛋白质本身就是各无比大的立体障碍 ligase 再反应时会被两各蛋白质所阻挡 所以我认为机会不大 : 否则就分别分开两个domain做labelling : 然後用化学合成peptide的方式 : 把两个domain以一级结构的方式合成 再筛选 : 不然在两个domian的C-ter与N-ter各接上DNA/RNA : 以及DNA/RNA binding domain然後丢在一起 : 好吧 我承认我是来乱的 可是这是我认真想出来的 化学合成peptide 的方式太过剧烈 在peptide bond 合成完前..我的两蛋白质早以 denature 且越大越复杂的蛋白质越不好 renature.. 另一个问题是 peptide synthesis 需要以t-Boc保护 amino group, 但是蛋白质本身不只有 N 端有amino group 像 lys, Arg 等表面上的胺基酸的 R gruop 都带有 amino group 这些都会使反应 nonspecific 如果以一级结构的方式 solid phase 合成peptide 再结合在一起 那别说15 kDa 的蛋白质了 只怕 5 kDa 的蛋白质都无法合成出来 且以此合成效率 (越长越低) final 不可能用以 NMR 来测蛋白质结构的 (NMR 测 protein 所需浓度极高) 不过 非常谢谢你的建议 希望您有更新一步的想法供我们做参考 Gratefully yours --

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