※ 引述《paraheamly (一了百了 是我現在的心情)》之銘言： : ※ 引述《SPEman (speman)》之銘言： : : 收完 cell lysate之後準備跑 western blot, : : 卻發現lysis buffer加太多,導致蛋白質濃度太低而無法load gel, : : 所以勢必要濃縮protein才能繼續做下去... : : 學長跟我說有些實驗室的人會用加熱法來濃縮protein : : 好像是在50~60度左右,將裝protein的tube蓋子掀開來煮,使水蒸發掉, : : 只是不知道該煮多久呢? : : 不知道煮太久會不會傷害protein呢? : : (另外,用95度煮可不可以呢? peptide是共價鍵應該不會因此打斷吧?) : : 請問板上有人作過類似的實驗嗎? : : 不知道能不能分享你們濃縮protein的方法呢? : : 謝謝各位了^^ : 95度加熱 peptide band是不會斷，但會因氫鍵斷掉而恢復一級結構，露出疏水端 : 當再回到冰上這時hydrophobic force，會使得protein相互凝集而沈澱，無論妳用哪種 : 濃度測定法，測出的值一定不準確。若你的蛋白質耐熱度高至50～60度，則可以用加熱 : 但必須要用離心將部分已沈澱的蛋白取出，只保留上清液亦可。 : 一般濃縮，會採用超薄膜濃縮，若是小體積的，可用millipore的centricon(有更新一代 : 的，我忘了他的名字)，過濾膜10KDa以上，再以離心力將多餘的水分去除，5ml可濃縮至 : 200ul。大體積，如：100ml~300ml則可用stirred cell，或hollow fiber進行濃縮， : 若沒錢，但已知蛋白質的疏水性極高，可用硫酸銨沈澱後，透析或loading desalt : column。 : GOOD LUCK 1. 加熱或是抽乾是個方法 但無法去鹽 假使鹽過高 會造成跑的很醜 2. 如果只是要loading gel check protein, 用 centricon 太貴(約兩百到四百元) 不合乎成本 3. 用硫酸胺沉澱後透析 太花時間. 用acetone 沉澱 會loss 掉一些protein 我的解決方式 自製centricon.. 把你的sample 取約 50uL 放到 eppandrof 的蓋子的凹槽 上面加個透析膜 (約1平方公分) 蓋緊 約 3000rpm 離心個數分鐘到數十分鐘 即可濃縮 又不太貴 出來後的體積約 10uL 剛好夠你跑電泳 不過操作時手要細點 --

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