※ 引述《paraheamly (一了百了 是我现在的心情)》之铭言： : ※ 引述《SPEman (speman)》之铭言： : : 收完 cell lysate之後准备跑 western blot, : : 却发现lysis buffer加太多,导致蛋白质浓度太低而无法load gel, : : 所以势必要浓缩protein才能继续做下去... : : 学长跟我说有些实验室的人会用加热法来浓缩protein : : 好像是在50~60度左右,将装protein的tube盖子掀开来煮,使水蒸发掉, : : 只是不知道该煮多久呢? : : 不知道煮太久会不会伤害protein呢? : : (另外,用95度煮可不可以呢? peptide是共价键应该不会因此打断吧?) : : 请问板上有人作过类似的实验吗? : : 不知道能不能分享你们浓缩protein的方法呢? : : 谢谢各位了^^ : 95度加热 peptide band是不会断，但会因氢键断掉而恢复一级结构，露出疏水端 : 当再回到冰上这时hydrophobic force，会使得protein相互凝集而沈淀，无论你用哪种 : 浓度测定法，测出的值一定不准确。若你的蛋白质耐热度高至50～60度，则可以用加热 : 但必须要用离心将部分已沈淀的蛋白取出，只保留上清液亦可。 : 一般浓缩，会采用超薄膜浓缩，若是小体积的，可用millipore的centricon(有更新一代 : 的，我忘了他的名字)，过滤膜10KDa以上，再以离心力将多余的水分去除，5ml可浓缩至 : 200ul。大体积，如：100ml~300ml则可用stirred cell，或hollow fiber进行浓缩， : 若没钱，但已知蛋白质的疏水性极高，可用硫酸铵沈淀後，透析或loading desalt : column。 : GOOD LUCK 1. 加热或是抽乾是个方法 但无法去盐 假使盐过高 会造成跑的很丑 2. 如果只是要loading gel check protein, 用 centricon 太贵(约两百到四百元) 不合乎成本 3. 用硫酸胺沉淀後透析 太花时间. 用acetone 沉淀 会loss 掉一些protein 我的解决方式 自制centricon.. 把你的sample 取约 50uL 放到 eppandrof 的盖子的凹槽 上面加个透析膜 (约1平方公分) 盖紧 约 3000rpm 离心个数分钟到数十分钟 即可浓缩 又不太贵 出来後的体积约 10uL 刚好够你跑电泳 不过操作时手要细点 --

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