作者a9044831108 (yoyo)
看板Biotech
標題WB的問題
時間Sat Jan 6 14:35:35 2024
很久沒有做了，這幾天做了2次，都是上了ECL肉眼可以看到band，但冷光儀完全照不到，
請各位大大解惑
https://i.imgur.com/gNChHyL.jpg
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1F：→ Bows: protocol 沒拿出來是要通靈嗎，我通靈一下應該是一抗或二抗01/06 16:10
2F：→ Bows: 太濃01/06 16:10
3F：→ florasflanaa: ECL肉眼可以看到bend就燒掉了吧01/06 17:09
4F：→ florasflanaa: 你蛋白下多少？一二抗的濃度是多少？貨號是什麼01/06 17:13
5F：→ florasflanaa: host和size有沒有仔細對照過ref.? ECL什麼等級？01/06 17:13
6F：→ florasflanaa: 有沒有壓過ponceau S和gel stain確認transfer效率01/06 17:15
7F：→ a9044831108: Sample的蛋白質濃度不確定，膠是用10 well，每個load01/06 20:47
8F：→ a9044831108: 20ul，現在用60V跑，再用90V跑，transfer用90V 80mi01/06 20:47
9F：→ a9044831108: n，Blocking 用5% milk 室溫1hr，1抗:CD-80(gtx0426001/06 20:47
10F：→ a9044831108: )1:1000 in 5%milk，4度overnight，2抗:rabbit(無貨01/06 20:47
11F：→ a9044831108: 號）1:5000 in 5%milk，室溫1hr，ECL（沒記貨號之後01/06 20:47
12F：→ a9044831108: 補充）01/06 20:47
13F：→ a9044831108: 之後strapping ，Blocking，1抗:GAPDH(abcam) 1:100001/06 20:47
14F：→ a9044831108: in 5%milk，4度overnight，2抗:mouse(無貨號）1:10001/06 20:47
15F：→ a9044831108: 0 in 5%milk01/06 20:47
16F：→ a9044831108: 之前另外一位有跑出來，冷光儀有照到，但我是什麼都 01/06 20:48
17F：→ a9044831108: 沒照到，肉眼就看得到band01/06 20:48
18F：→ a9044831108: 太久沒做，不確定是不是哪個沒配好01/06 20:48
19F：推 ysfang623: 先確定冷光儀操作有沒有問題，sample能不能序列稀釋？01/08 23:27
20F：→ ysfang623: 還有internal control 有沒有訊號01/08 23:27
21F：推 cyc5566: 肉眼可見，大概幾秒就燒掉了01/09 16:31
22F：→ xxtomnyxx: 有一個很蠢但我還真看過有人發生的可能...... 01/09 19:03
23F：→ xxtomnyxx: 1抗 and/or 2抗完沒有wash就直接加ECL.....01/09 19:04
冷光儀操作沒有問題，sample的量是照著前人load，重點是internal control也照不出來
，每個1抗跟2抗之間都有wash。後來二抗有調整濃度，改1:10000，也完全照不到，肉眼
都看得到，Protocol都是照著前人的，現在已經做到不知道哪裡有問題了
01/10 11:52
※ 編輯: a9044831108 (223.137.114.160 臺灣), 01/10/2024 11:57:51
24F：→ blence: 我想猜冷光儀,因為冷光儀已經可以可見光拍,沒必要另開手機 01/10 22:00
25F：→ blence: 而且我有超過一整年沒做WB,冷光拍要切換直接忘掉了 01/10 22:03
26F：推 florasflanaa: 你是說同時間做有人跑出來你沒有，還是時間有間 01/11 23:46
27F：→ florasflanaa: 隔？有間隔的話也可能有東西過期壞掉，去跟隔壁 01/11 23:46
28F：→ florasflanaa: 實驗室借sample和抗體當postive做看看，至少 01/11 23:46
29F：→ florasflanaa: internal ctrl要出來確定你的手法和儀器操作沒問 01/11 23:46
30F：→ florasflanaa: 題，然後才能從材料檢討 01/11 23:46
31F：→ florasflanaa: ECL最好也先跟別人借用 01/11 23:49