作者a9044831108 (yoyo)
看板Biotech
标题WB的问题
时间Sat Jan 6 14:35:35 2024
很久没有做了，这几天做了2次，都是上了ECL肉眼可以看到band，但冷光仪完全照不到，
请各位大大解惑
https://i.imgur.com/gNChHyL.jpg
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1F：→ Bows: protocol 没拿出来是要通灵吗，我通灵一下应该是一抗或二抗01/06 16:10
2F：→ Bows: 太浓01/06 16:10
3F：→ florasflanaa: ECL肉眼可以看到bend就烧掉了吧01/06 17:09
4F：→ florasflanaa: 你蛋白下多少？一二抗的浓度是多少？货号是什麽01/06 17:13
5F：→ florasflanaa: host和size有没有仔细对照过ref.? ECL什麽等级？01/06 17:13
6F：→ florasflanaa: 有没有压过ponceau S和gel stain确认transfer效率01/06 17:15
7F：→ a9044831108: Sample的蛋白质浓度不确定，胶是用10 well，每个load01/06 20:47
8F：→ a9044831108: 20ul，现在用60V跑，再用90V跑，transfer用90V 80mi01/06 20:47
9F：→ a9044831108: n，Blocking 用5% milk 室温1hr，1抗:CD-80(gtx0426001/06 20:47
10F：→ a9044831108: )1:1000 in 5%milk，4度overnight，2抗:rabbit(无货01/06 20:47
11F：→ a9044831108: 号）1:5000 in 5%milk，室温1hr，ECL（没记货号之後01/06 20:47
12F：→ a9044831108: 补充）01/06 20:47
13F：→ a9044831108: 之後strapping ，Blocking，1抗:GAPDH(abcam) 1:100001/06 20:47
14F：→ a9044831108: in 5%milk，4度overnight，2抗:mouse(无货号）1:10001/06 20:47
15F：→ a9044831108: 0 in 5%milk01/06 20:47
16F：→ a9044831108: 之前另外一位有跑出来，冷光仪有照到，但我是什麽都 01/06 20:48
17F：→ a9044831108: 没照到，肉眼就看得到band01/06 20:48
18F：→ a9044831108: 太久没做，不确定是不是哪个没配好01/06 20:48
19F：推 ysfang623: 先确定冷光仪操作有没有问题，sample能不能序列稀释？01/08 23:27
20F：→ ysfang623: 还有internal control 有没有讯号01/08 23:27
21F：推 cyc5566: 肉眼可见，大概几秒就烧掉了01/09 16:31
22F：→ xxtomnyxx: 有一个很蠢但我还真看过有人发生的可能...... 01/09 19:03
23F：→ xxtomnyxx: 1抗 and/or 2抗完没有wash就直接加ECL.....01/09 19:04
冷光仪操作没有问题，sample的量是照着前人load，重点是internal control也照不出来
，每个1抗跟2抗之间都有wash。後来二抗有调整浓度，改1:10000，也完全照不到，肉眼
都看得到，Protocol都是照着前人的，现在已经做到不知道哪里有问题了
01/10 11:52
※ 编辑: a9044831108 (223.137.114.160 台湾), 01/10/2024 11:57:51
24F：→ blence: 我想猜冷光仪,因为冷光仪已经可以可见光拍,没必要另开手机 01/10 22:00
25F：→ blence: 而且我有超过一整年没做WB,冷光拍要切换直接忘掉了 01/10 22:03
26F：推 florasflanaa: 你是说同时间做有人跑出来你没有，还是时间有间 01/11 23:46
27F：→ florasflanaa: 隔？有间隔的话也可能有东西过期坏掉，去跟隔壁 01/11 23:46
28F：→ florasflanaa: 实验室借sample和抗体当postive做看看，至少 01/11 23:46
29F：→ florasflanaa: internal ctrl要出来确定你的手法和仪器操作没问 01/11 23:46
30F：→ florasflanaa: 题，然後才能从材料检讨 01/11 23:46
31F：→ florasflanaa: ECL最好也先跟别人借用 01/11 23:49