作者blence ( )
看板Biotech
标题[讨论] Full-length cDNA cloning
时间Thu Feb 10 23:02:44 2022
一般要clone一个基因的全长序列，
就设计能涵盖cds的primer去放大目标基因的cDNA
不过如何认定哪一条才是全长越来越难判断，特别是人的基因
不知道做cDNA cloning时有没有选择isoform明确的依据或共识，
像是cds最长？exon最多？或是表现最高？
有想过只要跟发表过的lab索取就可以引用该paper来背书
但这样好像怪怪的，不是真的解决问题
举我遇到的基因为例，先简化只看表现量最多的前两个isoform
E2F3: cds较长的isoform(多131aa)，表现略低2倍
OAS2: cds较长的isoform(多32aa)，表现略高4倍，但exon/intron少一个
CD86: 两个isoform(差异6aa)，表现量不分轩轾
稍复杂一点的有FOXM1
isoform A序列最长，最多coding exon，但表现只占全部1/40
缺一个exon的isoform C表现量占19/40，缺两个exon的isoform B占20/40
更复杂的有遇到TCF7L2，宛如有polymorphic transcripts
当初cDNA cloning时就觉得它好像没有明显的isoform
原本还想过是不是需要人造的方式拼出可能不存在的全长
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1F：→ jjlee: 这是一个很重要，但10年後才有正确资料依循的问题，目前各 02/11 15:12
2F：→ jjlee: 大资料库有的是以 “最常被文献用到的 exon" or "所有的CD 02/11 15:12
3F：→ jjlee: S exon+最长的utr exon" 连接, 或者两者混合. 定义为 sel 02/11 15:12
4F：→ jjlee: ect or canonical transcript. 02/11 15:12
5F：→ jjlee: 基本上，会越来越趋向用 2nd or 3rd NGS 的定序资料来定义 02/11 15:14
探讨transcript是更深入的层次，我想问的没那麽重要啦
而且不同transcript往往差在前後UTR
只要保有相同的cds就无碍於平常的cDNA cloning
但是当透过transfect外表现一个基因来探讨有/无改变什麽现象时
使用的cds差异或许wild type/full lengt会变成mutantion/truncation了
6F：→ xxtomnyxx: 我觉得考虑哪一个是「全长」是没有意义的，重点应该在 02/11 18:57
7F：→ xxtomnyxx: 於你的研究是什麽？假如你想探讨的是一个基因在特定的 02/11 18:58
8F：→ xxtomnyxx: 时期(发育或成年)特定组织中的功能，那你只要拿该组织 02/11 18:59
9F：→ xxtomnyxx: 样本的 cDNA 做 cloning，得到的 isoform 就是你要的「 02/11 19:00
10F：→ xxtomnyxx: 全长」了，如果这个基因已经有很多已知 isoform，就在 02/11 19:00
11F：→ xxtomnyxx: paper 中写明 clone 到的是哪一个 isoform 就好了，如 02/11 19:01
12F：→ xxtomnyxx: 果样本中同时有 2 种甚至以上的 isoform 被表现，就要 02/11 19:02
13F：→ xxtomnyxx: 看是否有某一种 isoform 占大多数，甚至可以把有表现 02/11 19:03
14F：→ xxtomnyxx: 的都 clone 下来做分析，还可以探讨 isoform 是否分别 02/11 19:04
15F：→ xxtomnyxx: 具有不同的功能 02/11 19:04
是呀，目前是都先纪录是哪个NCBI accession number
主要是看到作者会在M&M提到"全长"的clone，尤其跟自己的长不一样时
总会猜想是不是有什麽常用的判别方式
至於探讨各别isoform就偏离方向了，还是留给有兴趣的人做
喔对了，要挑哪个isoform也可能在设计primer的阶段就决定了
运气不好的话得换过几组primer才能成功
16F：→ Ice9: 细胞株、实验条件不同，得到的clone有时候就不一样。我们的 02/12 09:01
17F：→ Ice9: 经验是看到不一样就从splice site看合不合理，没问题就不同 02/12 09:01
18F：→ Ice9: clones都拿下去做验证。 02/12 09:01
19F：→ Ice9: 早期会用Northern blot看可能的isoforms及表现量做决定 02/12 09:09
20F：→ Ice9: 现在是看大家拿哪个就做哪个，除非有其他考量。 02/12 09:11
以前的确会这样，透过site-direct修改成paper用到的isoform
21F：→ Ice9: isoforms这种东西真的很看运气，要探讨的基因倒霉的话就有 02/12 09:19
22F：→ Ice9: 成千上万个isoforms，又或是readthrough transcripts。 02/12 09:19
23F：→ jjlee: 大概再五年，就能便宜的进行第三代 FL-cDNA/RNA 定序. Clo 02/12 10:52
24F：→ jjlee: ning之前先把 target gene有哪些 expressed isoforms, 且 02/12 10:52
25F：→ jjlee: 这些 isoforms 个别的表现高低都能知道，届时再合成出对应 02/12 10:52
26F：→ jjlee: 量的 FL isoform clones 进行实验. BTW, Tp53 是一个同时 02/12 10:52
是指每次用isoforms pool取代单一clone做transfection吗？
这不太可能吧，相对量无法轻易的透过表现数个clone还原出来
不过若用表现量最高这个原则，我也比较偏好如此
目前我的做法是从GTEx找出表现量最高transcript後去cloning
因此难免遇到跟NCBI认定最长的FL isoform有差异
後来也出现了与paper上提到的序列不一致的问题
这就是最大的顾虑
27F：→ jjlee: 间有许多 isoforms 进行蛋白质表达的基因, 现在很多的 RNA 02/12 10:52
28F：→ jjlee: 研究都忽略这个重要因素. 02/12 10:52
※ 编辑: blence (118.233.138.244 台湾), 02/12/2022 18:20:25
29F：→ xxtomnyxx: 通常要 clone 一个基因时，我设计 primer 会以 NCBI 02/12 19:56
30F：→ xxtomnyxx: ref-seq 中编号最小，或位数最少的 NP sequence 为准， 02/12 19:57
31F：→ xxtomnyxx: 另外，与其用 isoform pool，我到宁愿用 piggybac 直接 02/12 19:58
32F：→ xxtomnyxx: 送 gene locus 进去让细胞自己决定要表现哪些 isoform 02/12 19:58
33F：→ xxtomnyxx: #送用constitutive promoter 或 inducible promoter 02/12 20:02
34F：→ xxtomnyxx: drive 的基因 locus 02/12 20:02
35F：推 jjlee: “NCBI认定最长的FL“ 没有考虑到组织/细胞表现特异性，原 02/12 20:30
36F：→ jjlee: Po用GTEx会比Refeq select isoform更合理 02/12 20:30
37F：→ blence: 没错,若参考的NCBI序列没P出来,不一定是技术问题 02/14 00:27
38F：→ blence: 就像上面说的情况,这时换掉primer或换细胞就好了 02/14 00:28
39F：推 michaelhsien: 试试看 CRISPR activation？(dCas9-SAM) 02/17 00:15
40F：→ jjlee: CRISPR activation 启动了内生性基因，但 target isoform 02/18 12:16
41F：→ jjlee: 是否能产生是个问号，直接塞一个剪好的较直接 02/18 12:16
42F：→ blence: CRISPRa/i也是要cloning,该面对的isoform还是避不掉 02/18 14:22
43F：→ blence: 况且cDNA cloning增加表现只是功能之一,另有更多实验目的 02/18 14:26
44F：→ xxtomnyxx: micha版友的意思应该是不使用 vector 表现，而改用 02/18 14:49
45F：→ xxtomnyxx: CRISPR activation 去起动基因表现，由组基或细胞自己 02/18 14:50
46F：→ xxtomnyxx: 本身拥有的机制决定要表现哪些 isoform。不过这样只能 02/18 14:51
47F：→ xxtomnyxx: 解决 alternative exon 的 isoform，遇到 alternative 02/18 14:51
48F：→ xxtomnyxx: TSS 的 isoform 也是不知道要启动哪一个就是了 02/18 14:52
49F：→ xxtomnyxx: 启动 组织 02/18 14:52
50F：→ xxtomnyxx: 不过这方法也怪怪的，样本细胞本身就不表现这个基因， 02/18 14:53
51F：→ xxtomnyxx: 做出来的 isoform 到底具有什麽意义实在很难回答 02/18 14:55
52F：→ jjlee: 这倒是一个有趣的issue, 感觉会出现很多种可能 02/18 17:52