作者jpkiku0211 (YY)
看板Biotech
标题[求救] western blot 小分子蛋白跑不出来
时间Tue Nov 26 17:07:41 2019
(手机排版乱掉抱歉QQ)
目标蛋白分子大小为17kDa, internal control 45kDa
下样为25ug
上胶7.5% 下胶15%
Running的时候120V 20min过上下胶交界线就改100V 2hr直到marker跑开接近1/5底板时停止
使用NCm，有接受别人建议先泡methanol结果烂掉(?)於是换新
Transfer(湿转)条件有试过200mA/45min、200mA/1hr、300mA/90min、300mA/2hr
Transfer的话除了200mA/1hr有完全的transfer过去，剩下的都会残留在胶上，没有染胶所
以确认方式就是看marker是否完全转过
尤其200mA/45min的後续wash的时候连marker都会被洗掉近乎没有
Actin都有跑出来也是对的位置
但目标蛋白的membrane，会看到一些band卡在裁切最上缘或最下缘，总之不是目标位置
想问是transfer的条件或是Running 的问题吗？
或是要改成PVDF吗？
谢谢大家！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 180.204.230.11 (台湾)
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1F：→ blence: 有人建议你把NC跑methanol？11/26 18:02
2F：→ a90648: NC泡methanol就融掉了阿 他说的是PVDF吧11/26 18:23
3F：→ a90648: 你要确认清楚啊11/26 18:24
我有确认过，是说NCm泡没错，我也是泡了就溶掉QQ後来问说沾一下，但也是沾一下就烂掉
※ 编辑: jpkiku0211 (180.204.230.11 台湾), 11/26/2019 22:01:00
4F：推 leptoneta: 不管别人说什麽 请从单纯NC或者是PVDF泡甲醇二选一11/26 23:57
好的谢谢QQ
5F：推 bob79620: PVDF泡甲醇，wet transfer 180mA/3 hr11/27 00:21
请问这样不会有tran过头的问题吗？
※ 编辑: jpkiku0211 (180.204.230.11 台湾), 11/27/2019 00:44:23
6F：推 tynse71864: 若目标只有17/45，为何要做 step gel阿? 另，这个蛋11/27 04:27
7F：→ tynse71864: 白大小我大概 100V 55min 就好了11/27 04:27
8F：→ tynse71864: 我用 pvdf11/27 04:29
可以请问一下什麽是为什麽要做step gel的意思吗QQ
9F：→ bringing: 用甲醇是要活化PVDF 使表面带正电 可跟带负电的protein11/27 09:04
10F：→ bringing: target , NC膜大部分不用甲醇11/27 09:04
但前辈真的写NC泡methanol还做出来东西QQ
11F：推 Ianthegood: actin有跑出来应该是有转好喔 你的条件也不像是会tran11/27 17:24
12F：→ Ianthegood: sfer过头加上marker还在 铁口直断问题不是transfer11/27 17:24
!!!但actin跑出来的band也是挺奇怪的就是，谢谢回答！！
※ 编辑: jpkiku0211 (140.112.4.192 台湾), 11/27/2019 20:35:02
13F：推 tynse71864: 哦我看懂了 我以为你下胶有两种%数…没事没事11/27 22:18
好的！
14F：推 datro: 这大小还好 不过 有0.2um PVDF可以换用 NC不能碰甲醇11/27 23:19
15F：→ datro: 然後 有actin的图的话 可以放上来看 然後 电流可以开到40011/27 23:20
16F：→ datro: 但是 可能要看看有没有过热 保冰效果如何11/27 23:20
刚刚重跑了一次，这次换成0.22的PVDF膜了！transfer的话是buffer里有放冰宝，外面放碎
冰，刚刚看是200多的marker没有转完全但下面的都有转过去的样子(100V/60min)
17F：推 Ianthegood: 啊你讲actin有跑出来位置也对 後来又讲跑得很奇怪 又11/28 01:45
18F：→ Ianthegood: 不放图 是要版友读心逆11/28 01:46
不好意思QQ!!因为上次跑的後来才发现抗体好像有问题，所以位置对但band怪怪的，这次跑
换新买的抗体，想说看如何再放图上来，不好意思也真的感谢大家的回答！
※ 编辑: jpkiku0211 (49.219.133.17 台湾), 11/28/2019 04:35:19
19F：推 MADAOTW: 一般transfer buf 里面就含有甲醇了，化掉是别的原因吧？11/28 14:30
20F：→ a90648: buffer里的甲醇浓度跟你直接碰纯的甲醇不能比阿 11/28 17:09
21F：推 Ianthegood: nc可溶於甲醇 做得出来表示你前辈笔记太唬烂11/28 20:37
22F：→ hitmd: 谁要给搞你，NC还泡 ...11/29 13:11
谢谢大家的建议QQ今天看actin正确，只是深浅不一浓度可能要重测；而目标蛋白则是很一
致的落在15kDa 我可能要再去看paper想想这是怎麽回事 但至少小分子蛋白跑得出来了，
谢谢各位QQQQ
※ 编辑: jpkiku0211 (140.112.96.10 台湾), 11/29/2019 16:39:42
23F：推 Ianthegood: 跑个qRT确定有表现啊11/29 17:11
有跑过ELISA确认过了～
※ 编辑: jpkiku0211 (101.12.0.18 台湾), 11/29/2019 21:06:44
24F：推 ai760721: 请问原po後来是改什麽条件压出来的呢？我最近也有一个9k 12/02 17:59
25F：→ ai760721: Da的压不出来～_～ 12/02 17:59
26F：推 joseph103331: 17kDa,怎麽看都是Blotting的问题比较多 12/12 00:17
27F：→ joseph103331: 0.45的PVDF或NC,17kDa跑不过去的啦 12/12 00:18
28F：→ jaren229: 比较常出现的问题都是0.22跟0.45的membrane乱用吧 02/13 16:14