作者sianpa00 (ccc)
看板Biotech
标题[求救] invasion assay
时间Fri May 3 16:48:58 2019
各位好
由於最近要做transwell invasion assay 但是不知道为什麽，细胞种在matrigel上24小
时之後都会变成白色的沉淀，各个浓度都试过了，也在96well上铺胶试过，细胞都有贴，
但在transwell上就无法，想拜托大家帮帮忙！
以下是我的protocol,用的细胞是4T1
1.将matrigel以1:3 ,1:5, 1:7 稀释，并coating 50ul在insert上，放37度24H
2.将细胞种在transwell上室， 5＊10^4/100ul in serum free medium
3.下室加500ul 10%FBS medium
隔天看就发现沉淀了，也没有细胞穿过
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.112.54.111
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1556873340.A.381.html
1F：→ raiyu: 实验室之前有人作过吗？我的方法是1：10稀释，coating 10005/07 23:27
2F：→ raiyu: ul，37度放30min，用tip吸掉多的，再放细胞05/07 23:27
没有人做过耶，我之前试过1：10，但感觉不太成胶耶，很水漾，而且我是放24小时QQ，
另外想请问一下您用的t
ranswell是什麽牌子呢？我是corning的，不好意思麻烦您了！
※ 编辑: sianpa00 (140.112.4.206), 05/08/2019 13:54:30
※ 编辑: sianpa00 (140.112.4.206), 05/08/2019 13:55:45
3F：→ raiyu: 是的1：10还会是很像液态的，我也是corning的05/09 23:03
4F：→ raiyu: google得到corning的protocol，虽然我也是看前人的05/09 23:12
好的，感谢，那我再试试看1：10的，那可以请问一下,30分钟後吸掉，不会几乎没有matr
igel吗？
※ 编辑: sianpa00 (140.112.54.111), 05/10/2019 11:33:13
5F：→ raiyu: 理论上孔洞有就可以了05/10 12:26
6F：→ raiyu: 如果是明显的一层不就会变成在transwell上做tube formatio05/10 12:28
7F：→ raiyu: n了吗？我猜你的细胞是不会行成tube的所以你才会只看到细05/10 12:28
8F：→ raiyu: 胞沉淀05/10 12:28
9F：→ raiyu: 不过建议还是找corning的protocol看一下，老板问起来也才05/10 12:30
10F：→ raiyu: 有个依据05/10 12:30
11F：→ raiyu: 然後爬过去的细胞会是transwell的另一面，我的经验是不太05/10 12:40
12F：→ raiyu: 会在下层medium中，所以你如果是看medium或下面的well是不05/10 12:40
13F：→ raiyu: 太会有细胞的05/10 12:40
感谢你，我会把matrigel铺少一点试试看，不好意思麻烦您！
※ 编辑: sianpa00 (223.136.86.184), 05/13/2019 10:08:23
不好意思再请问一下，我最近照您的步骤做，有做出来，但是吸出多的matrigel的时候，
几乎整个吸光了，这样是否不太正常 感觉好像根本没有成胶，我还把时间拉长到1h
※ 编辑: sianpa00 (114.136.246.122), 05/19/2019 11:45:39
14F：推 Devilxxx: 我之前做invasion是用80ug/mL的浓度（用medium稀释matri06/12 00:22
15F：→ Devilxxx: gel）然後37C coating过夜，没有吸除多余的06/12 00:22
16F：→ Devilxxx: 查了一下当时收到的Matrigel原液浓度为9.6mg/mL 我是先06/12 00:24
17F：推 Devilxxx: 1:1稀释成4.8mg/mL的stock全部分装完，一次拿一管出来再 06/12 00:26
18F：→ Devilxxx: 稀释成80ug/mL的working sol做coating 06/12 00:26
19F：→ Devilxxx: 一开始分装就先算好每次只拿一管出来的量（稀释後体积务 06/12 00:27
20F：→ Devilxxx: 必超过你实际要用的总体积避免气泡和pipetting error）06/12 00:28
21F：→ Devilxxx: 以稀释倍率来看的话是120倍稀释呢 所以原液浓度很重要06/12 00:28
不好意思 现在才看到回覆，80ug/ml,超稀的耶，我目前是用400ug/ml左右，大概是1：20
稀释，37度放到乾，之前看paper太担心matrigel过稀，也许就是原液浓度不同？ 看来好
像多虑了！ 谢谢你们的帮忙！
※ 编辑: sianpa00 (140.112.54.111 台湾), 06/24/2019 15:04:36
22F：推 Devilxxx: 浓度越高那层胶会越硬，硬的话细胞吃不掉就穿不过了不是 08/24 02:05
23F：→ Devilxxx: 吗？@@ 08/24 02:05