作者angel810801 (阴雨绵绵)
看板Biotech
标题[求救] ligation失败
时间Wed Jun 8 15:29:45 2016
各位好 最近在做一个clone
但是转型後 一直没有长出菌落
胜任细胞是使用市售的DH5a
因此怀疑应该是ligation的部分出问题
以下是我做的条件
vector大小为5400 bp
insert大小为1000 bp
两者 RE 剪切完後clean up
vector 浓度为 23.5 ng/ul
insert 浓度为 10.5 ng/ul
使用I:V=3:1的比例去接，vector加入的量订为100ng
insert 6 ul
vector 5 ul
ligase 1 ul
10X buffer 2 ul
ddH20 6 ul
_____________________
20 ul
ligation的时候，会先将除了ligase外的，先以45度加热5分钟
之後再加入ligase
有尝试过(1)4度 O/N
(2)16度 1.5 hr → 4度 O/N
最後用 5 ul 加入胜任细胞做转型(因为>6K，所以有做heat shock)
结果一颗菌落也没有长...
我们ligation buffer买来就有分装成小管
每次要用才拿一管出来
因此应该没有反覆冷冻解冻坏掉的问题....
请问
(1)是我insert和vector加的量太少吗?还是应该提高I:V比例(1:5 or 1:7)?
(2)还是我ligation的的时间/温度不对?
另外想问 如果ligation有剩下的
可以放到-20下次再拿出来直接转型使用吗?
先感谢各位的帮忙 > <
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1F：推 tony51501: 我vector浓度都大概1.x ng/ul 06/08 15:45
2F：→ tony51501: 你用的抗生素？盘子抗生素浓度？ 06/08 15:45
我是使用kanamycin 30 ug/ml
3F：→ darkdoor: 可以尝试16度overnight 06/08 15:53
4F：推 elite2: ligase buf.里面有ATP不要去加热！效率会变很差 06/08 15:54
5F：→ elite2: 另外，12-16度overnight会比较好～ 06/08 15:55
加热是老师给的建议，说他以前的做法
好 我会改试试看16度 O/N
6F：→ hitmd: 跟别家做的出的借一下ligase，有时候活性有差 06/08 16:04
LAB其他人也都用同样的东西做 但是有成功><....
※ 编辑: angel810801 (140.121.155.195), 06/08/2016 17:43:13
7F：推 oceanl: heat shock後有放培养箱recover吗？有试过把20ul全下吗？ 06/08 17:47
市售的protocol没有写放培养箱recover....我下次试试看
因为他是建议加入的DNA量不要超过1%(一管是100ul)
加上之前我们老师也是说最多不能超过5 ul
20 ul 全加不会给胜任细胞太多压力吗?
※ 编辑: angel810801 (140.121.155.195), 06/08/2016 17:50:37
8F：→ blence: 同一楼看法,Kan仍建议recover;DNA方面5-10%就好,20太多了 06/08 18:48
9F：→ blence: 不过ligation与其补水,而且才用5ul,不如控制体积10ul以内 06/08 18:51
10F：推 qazbamboo: 我大部分都放室温一个小时跟胜任细胞10:50 06/08 20:38
11F：推 lail: kan的菌要recovery+1, 然後我以前ligation是在室温3-4小时（ 06/08 21:13
12F：→ lail: 隔壁学姐室温1小时），给你参考 06/08 21:13
13F：→ Ianthegood: 量多没好处, ligase一般都建议vector 50ng当基准调整 06/08 21:17
14F：→ skyken10: 跑个胶确认一下ligation的效率！ 06/08 22:49
15F：→ blence: 跑胶? 以10^7效率看1ng就有1万颗了,1ng跑胶看得到? 06/08 23:07
16F：→ blence: transform长起来的DNA量,远少於跑胶侦测的灵敏度极限阿 06/08 23:11
17F：→ Ice9: 试试ligation完加热一下，某种程度上可增加transform效率 06/09 04:59
18F：推 aaaazzzz: 先前也遇到ligation完全没长(kanamycin),後来步骤多了LB 06/09 12:33
19F：→ aaaazzzz: 加入後，置放37度45分钟就有长了 06/09 12:34
20F：推 joseph103331: 我用Quick ligase, 室温15分钟就好了 06/09 15:59
21F：→ joseph103331: 如果vector没有做切胶分离, 完全没长肯定是ligase 06/09 16:00
22F：→ joseph103331: 或是没有recover的关系, 参考产品protocol去做就好, 06/09 16:01
23F：→ joseph103331: 先不要用一些其他的经验去操作 06/09 16:01
24F：推 tynse71864: recovery +1 ligation 有这步比较好长～ 赶时间大概15 06/09 23:55
25F：→ tynse71864: -20分钟就行了 06/09 23:55
26F：推 o81628: 学姊我在这（举手） 06/10 01:21
27F：→ osla30: 不要用cleanup改跑胶切胶纯化试试 06/10 01:33
28F：→ osla30: insert与vector以65度加热5分，冷却後再加ligase与buffer 06/10 01:41
29F：→ osla30: 试试 06/10 01:41
30F：→ osla30: insert我通常会给多一点 06/10 01:43
31F：推 qumai: 胜任细胞体积多少? 加了5uL ligation product 已经很多了 07/06 13:43
32F：→ qumai: Kna一定要recovery不然效率会很差, heat shock之後加SOC 07/06 13:45
33F：→ qumai: 37度摇一个小时吧, plate也37度C先温一下 07/06 13:45
34F：推 jamesonly: 我自己还会额外加ATP>< 怕buffer的没用了 07/12 22:39