作者Dauthi (斩不断的思绪)
看板Biotech
标题Re: [讨论] 做IHC所使用的sample
时间Wed Sep 25 16:14:49 2013
※ 引述《KTXNS (Yeah!大佛!)》之铭言：
: 问题是这样 3个多月前我做了一批Tg mice肝脏石蜡切片
: 做IHC染色(B肝病毒蛋白) 结果很明显是Positive
: 但是背景有点太深(偏红)一直想重染 但一直到最近才有空
: 和另外一批刚切的片子一起染 结果刚切的染出positive了
: 之前切的却没染出来 试了两次都一样
: 我怀疑可能要重切 但有学长觉得应该不是这问题...
: 不过具体有什麽问题他也说不上...只叫我再试~
: (不过大家知道的...抗体不便宜阿 虽然我会recycle...)
: =========
: 想请教会做IHC的各位
: 切片到染IHC最长会摆多久 会到3个月吗?
: 谢谢!
做过不少IHC依经验回答一下
1.最近这次染的抗体是重新配置的还是拿上次稀释好的重用？
这关系到抗体活性 事隔这麽久如果是以稀释好的抗体可能早就没活性
2.切片放置时间
这我没办法回答很正确的答案 这也关系到抗原蛋白的问题
但在自己以前的经验上觉得已经被福马林固定过的的蛋白要再变性的机会很低
通常我们在做实验要染色的切片 如果要染的数量很大的话
都会建议一次把整个蜡块切完 因为每次重切(如你说的会在蜡块上封一层蜡)
都要再多削掉几块 这样能染的组织片数就会减少(有些组织得来不易阿)
也这样放过好几个月甚至几年都还可以染的到阳性
另外以前待的实验室也有人做过放了十几二十年的蜡块(病毒性疾病)
再拿出来切片染IHC还是可以侦测的到病源 所以切片放置时间理论上应该不会受到影响
3.抗体recycle
我本身是没有试过抗体recycle之後再继续染色的经验
所以关於这点想知道的是当初您有用recycle过的抗体再染一次新的切片吗？
本身没做过 所以比较怀疑recycle之後的抗体效力 这点有待确认
至於蜡块切完上面会封一层蜡详细情形我也忘了是为什麽了
印象中是怕保存时因为疏失直接伤害到组织 所以再给他一层保护
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.98.120
1F：推 KTXNS:...你说的没错 recycle後的抗体效果确实会变差... 09/25 16:22
2F：→ KTXNS:我最近这次用的也是别人最近做完recycle的...好...我再试吧 09/25 16:24
3F：→ KTXNS:谢谢! 09/25 16:24
4F：推 KTXNS:另外 固定太久也会影响antigen是吗? 09/25 16:27
5F：→ Dauthi:固定太久会 然後脱蜡时放在Xylene里面太久也可能会 09/25 16:47
6F：→ Dauthi:说"可能"会是要看抗原 我有放在Xylene里面四天还是染的出来 09/25 16:47
7F：→ Dauthi:但也有放了四个多小时忘记了 之後就完全染不出来的... 09/25 16:48
8F：推 KerryWood:所以重点是抗原呈现那步呀 09/25 19:47
9F：推 KTXNS:pH6.0 citrate acid autoclave 15 minutes 09/25 20:06
10F：→ KTXNS:citric acid buffer为10mM 应该没问题我想 09/25 20:07
11F：→ Dauthi:抗原呈现不同抗体对不同的buffer反应都不一样 09/26 09:31
12F：→ Dauthi:之前实验室有试过同一支抗体染同样的组织 用不同的buffer 09/26 09:31
13F：→ Dauthi:不出来的就是打死都不出来 每种buffer pH都不一样 09/26 09:32
14F：→ Dauthi:需要用的抗体也不同 不过如果以前用这种buffer以及同样方法 09/26 09:33
15F：→ Dauthi:就染的出来 那我就会往其他方面去思考 09/26 09:33
16F：→ Dauthi:因为照原po所说的 他先前就染出来过了 所以我比较怀疑 09/26 09:34
17F：→ Dauthi:是抗体的问题 可能先配制新的一批抗体来染看看再确定 09/26 09:34
18F：→ goshr:同时染, 以前切的没染出来, 新切的有染出来, 那就重切吧 09/26 11:25
19F：→ goshr:不就只有一个变因吗 ^^ 09/26 11:25
20F：→ goshr:不过如果你的目的是想探讨为什麽以前染得出来 现在染不出来 09/26 11:26
21F：→ goshr:那就另当别论了, 09/26 11:26
22F：→ goshr:某个病理部的主任说过, 切片要用蜡封起来, 不然几个月後 09/26 11:27
23F：→ goshr:染色的效果会降低, 所以後来我帮人切TMA的片子时都会用蜡封 09/26 11:27
24F：推 KTXNS:谢谢各位 大家的意见惠我良多阿!! 09/26 17:21
25F：→ KTXNS:想请教 如果一个号称可以同时染WB&IHC的抗体 如果用WB时有 09/26 17:24
26F：→ KTXNS:一些non-specific band 那染IHC时的Positive我应该信吗? 09/26 17:25
27F：→ KTXNS:antigen retrieval的buffer是实验室protocal的 我也没想到要 09/26 17:27
28F：→ KTXNS:换过 请问是怎样的情况下需要考虑换Buffer呢?怎麽换 一种一 09/26 17:29
29F：→ KTXNS:种试?还是可以在 antibody的data sheet上可以找到什麽端倪? 09/26 17:31
30F：推 KTXNS:驯~我跟另外的学长/朋友讨论过 他们有些从不recycle Ab. 09/26 17:36
31F：→ KTXNS:有些是说如果recycle 要加一些东西 反正没听到有人像我这样 09/26 17:37
32F：→ KTXNS:的...(果然是我太抠了?我只是一天到晚厅老板抱怨没钱蛮慌的) 09/26 17:39