作者puec2 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)
看板Biotech
标题Re: [求救] E.coli electroporation
时间Wed Feb 6 22:17:50 2013
※ 引述《shiningspark (阿冠)》之铭言：
: 请问各位
: electroporation如何避免电爆呢?
: 最近每电必爆
: 前阵子成功率还蛮高的，快气死人了
: 实验的条件为1900 V
: 约40 ul competent cell
: 加10 ul ligated plasmid
: 外观看起来没有气泡，水滴也有擦乾
: plasmid量太多会有影响吗?
: 或是plasmid体积太大影响电阻?
: cuvette也有放冰上预冷
: 但预冷是要把整根金属部分都埋进去呢?
: 或是大概菌液会接触到的部分就足够?
: 还有其他可能失败的原因吗?
: 实在是电到很挫折啊...
.......
Ligation buffer里面就是满满的盐类
我们有两个解决方法
1. Ligation结束先做酒精沉淀 最好加Glycogen东西才比较不会不见
2. 1 ul的ligation product+100ul competent cell
早期是用1, 但是太麻烦然後我现在用2
Ligation有成功的话 会长到整盘满满几千颗colony
没 一颗都没有 (不要跟我挑语病)
另外你电菌的电压太高了 不用这麽高 我用1700V就很够了
至於你说早期会成功 真的还蛮神奇的 我用1ul+50ul去电
电压设定1700V 但都会电爆 你用10+40还可以电成功 可以
请问你用的是哪一家ligase吗?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
1F：推 shiningspark:我们家用fermentas的T4 ligase喔 02/07 15:25
2F：→ shiningspark:话说我们家之前的人都是10ul ligation product全部电 02/07 15:26
3F：→ shiningspark:下去都OK说，不过他们大概用80ul competent cell就是 02/07 15:28
4F：→ shiningspark:也许应该乖乖用80或100ul competent cell来电 02/07 15:32
5F：→ puec2:这样看起来fermentas的buffer配方比较特殊 02/07 16:51