作者domoto01 (Chia)
看板Biotech
标题[求救] western ECL反应条件
时间Mon Jan 21 22:38:01 2013
有关western最後一步以冷光呈色剂ECL反应，我们家得做法是：
洗好2抗的膜会放在已剪开得自黏式塑胶膜上，
然後以p1000 pipetman吸取3ml得ECL试剂来回均匀淋在膜上，
最後把塑胶膜盖上，反应2~5分钟後，将ECL试剂擦拭乾净，
再使用冷光照相系统(UVP)侦测。
~问题来了~
老师每次看到结果图都会嫌弃我们是不是ECL没有淋均匀= =
操作给老师看之後，老师说我淋太快了这样不行。
因此第二次照着老师建议得速度做了一次，觉得还是很难控制> <
结果还是会有某一区块比较暗的情形，好像那一块淋到得ECL比较少的样子
我们家使用得ECL试剂是millipore的2合1那种。
我想请问大家ECL也是用淋得吗?有什麽诀窍可以做好这一步?
不然辛苦铸胶跑胶转印完hybrid完抗体，
结果败在最後一步实在很扼腕也很打击信心呀T T
另外就是我有看过别的实验室做法，
是像摇抗体那样，把膜放在ECL里面摇(反应)。
我想问问版上是否有人也是这样子做得呢?想要参考看看这样做该如何抓条件！
谢谢各位耐心看完我打得东西。
虽然WESTERN实验变异很多，但因为这一步一直被老师complain，
我又超无解得，实在很苦恼。
有搜寻过版上western相关文章，但发现大家讨论照不出东西比较多，
还有跑胶转印条件之类得.....
最後希望大家实验都能够顺利啦！谢谢各位^^
————————————做个分格线————————————
图片档案网址在这边，如果看不到请再和我说，谢谢各位(感恩)
http://ppt.cc/BT4h
◆ From: 219.84.253.154
1F：推 alaric:你可以先将A,B液混合(使用前), 膜先放在面纸吸到无水渍, 01/21 22:42
2F：→ alaric:再将膜移到乾净的容器或保鲜膜上, 淋上ECL, 将膜完全盖满, 01/21 22:43
3F：→ alaric:反应时间後, 可以再准备放到面纸上吸乾到无水渍,就封到胶膜 01/21 22:46
4F：→ alaric:上述流程,已经好久没用.现在都是直接在容器内呈色就去照相. 01/21 22:48
5F：→ blence:3ml,这至少可以覆盖8X6membrane好几倍,你的很大张?millipor 01/21 23:51
6F：→ blence:那一套反应时间应该1min就很够了,反应太久容易烧掉反白 01/21 23:52
7F：→ blence:没图,如果你的多余ECL水滞有吸掉,说不定是2抗造成讯号不均 01/21 23:54
8F：推 joseph103331:用摇的 8x6 cm 应该只要A+B 1~1.5 mL就摇得起来 01/22 01:23
9F：→ joseph103331:这步我们通常用手摇 约3min左右 01/22 01:24
10F：推 tsubasawolfy:拿个小盘子先把膜摆好後盘子斜个角度淋上去 01/22 08:54
11F：→ tsubasawolfy:在吸取聚到盘子一角的ECL重复淋 要让ECL均匀流过 01/22 08:55
12F：→ tsubasawolfy:时间控制在30s-1min 之後把膜夹起来舔擦手纸 正反 01/22 08:58
13F：→ tsubasawolfy:面都舔 保持湿润但不要有流动的形状就好 01/22 08:59
14F：→ tsubasawolfy:而且M牌反应速度很快很强 泡到5分钟都反应完了吧.. 01/22 09:01
15F：→ domoto01:to:blence 我使用的膜是9.5x5大小得。你说没图是指实验结 01/22 18:48
16F：→ domoto01:果图吗? 01/22 18:48
17F：→ domoto01:我们在做的时候真的有反应5分钟耶~主要会去调整曝光时间 01/22 18:52
18F：→ domoto01:除非真得太强，就会知道ECL不能反应那麽久。这样抓条件得 01/22 18:52
19F：→ raiyu:可以附个图吗? 01/22 23:21
20F：→ domoto01:请问用摇的时候是放在小盒子里面摇还是封口袋之类的东西? 01/23 12:09
※ 编辑: domoto01 来自: 140.136.181.22 (01/23 12:29)
21F：推 alaric:PCR盒的盖子很好用. 01/23 15:47
22F：→ domoto01:昨天学妹试做了，她用10ml重复使用，反应时间都是5min， 01/24 10:58
23F：→ domoto01:照第三张的时候就已经有点弱了。和老师讲的时候，他说ECL 01/24 10:58
24F：→ domoto01:不要重复使用呀...今天下午meeting老师说要来讨论ECL怎麽 01/24 10:59
25F：→ domoto01:这一步骤怎麽做来减少实验误差= = 01/24 11:05
26F：推 shiningspark:没重复使用过耶，A+B 大概1.5 ml用手摇+1 01/27 02:12
27F：→ domoto01:我的膜是9.5*5，1.5ml量好少膜根本淹不过，这样摇会反应 01/28 15:02
28F：→ domoto01:均匀吗?请问shin大的膜大小是? 01/28 15:03
29F：推 jasonstudio:我也用这款 基本上沾一下就可以去照了 01/29 17:04
30F：→ jasonstudio:怕乾掉就在多滴几滴在上面 最好是可以让膜上一直有 01/29 17:05
31F：→ jasonstudio:ECL试剂 01/29 17:05