作者travelmat (草蓆)
看板Biotech
标题[求救] bacterial colony hybridization
时间Thu Sep 6 17:16:06 2012
先简单叙述一下我的实验:
1.我有一个 PCR product跑GEL结果是smear，但推测其中有我要的片段
2.我将PCR product做TA clone，送入ECOLI涂plate长colony
3.我尝试找出带有某特定片段的colony并将他送定序
(dna序列可推测而得之，但定序前无法100%确定)
目前方向是利用colony hybridization (bacterial)
找的protocol是来自 Molecular Cloning
简单叙述一下流程
1.利用membrane沾一下plate上的clone
2.利用paper带有buff黏上membrane进行破菌粹DNA
3.让DNA binding
4.之後就同southern
我的问题是:
因为以 Molecular Cloning 上的 denaturing solution
中有个东西lab没有，只有一个功能相近的东西
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guanidinium thiocyanate ， guanidine hydrochloride
确定的是功能都是denature protein，但不确定的是在这份protocol可不可以取代
想请问大家意见。
另外就是
如果改找别份protocol，有版友有做过，推荐哪份protocol吗?
(目前问了一下，好像都没人做这实验.......)
或是有哪些细节需要注意的....
非常感谢各位
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.105
※ 编辑: travelmat 来自: 140.120.130.105 (09/06 17:18)
1F：→ RickyKckao:我觉得你可以试试colony PCR~ 09/06 18:17
2F：→ RickyKckao:应该比较简单@@ 09/06 18:19
感谢
其实我原本就是用colony PCR
但因为PCR product是smear，即使我先gel purify切下我要的片段大小区域
再进TA clone
出来的colony也是有很多不是我要的
colony PCR只能确定insert的片段size而已，无法确定该片段是不是我要的
(因为我要的该段序列我只能"推测"他的序列，再真正定序出来前无法100确定他的序列
所以如果是primer落在insert内部的方法就不可行....)
原本是考虑用colonyPCR看insert size，接着在用enzyme digest再check一次
size都对就送定序做最後确定
但老师觉得这种方法太乱枪打鸟了(或是太花钱?)
於是才叫我做colony hybridization........ ㄒ_ㄒ
※ 编辑: travelmat 来自: 140.120.130.105 (09/07 09:54)
※ 编辑: travelmat 来自: 140.120.130.105 (09/07 09:56)
3F：→ RickyKckao:不过hybridization不就要用insert内部的序列当probe吗 09/07 10:56
但那部份是先做出TEMPLATE然後用random primer做出probe
所以实际上我不太需要知道他确切的sequence，而是靠这样做出probe
这边是我个人的理解...
还是其实有其他方法我没想到??
※ 编辑: travelmat 来自: 140.120.130.105 (09/07 14:49)