作者kikixie (跟着我走你会迷路)
看板Biotech
标题[求救] PCR P不出来
时间Tue Aug 28 14:55:07 2012
我设计了一组 primer 并利用 Biomix 找到 Tm =56.6度 (基因size:787bp)
条件如下:
95度10min-->95度30s,56.6度1min,72度1min(40cycle)-->72度10min-->4度
结果...利用相同条件，只换 enzyme !!!
换成 High fidelity 就 P 不出来 >"<
原本想说可能是 high fidelity 有proof reading 的能力，需要 elongation 时间较长
所以我 elongation 的时间调成 10 min 结果也 P 不出来，学长说可能是 Tm 值太高，
所以我也试着改变 Tm 值 (改成53度) 还是一样...跑完胶好乾净 QQ
想请问各位有遇过这种事吗?该怎麽解决??
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生命跟人恶作剧
他骗人化进故事理去活
他用种种的情节引诱着人热烈的投入
人 先被故事捉进去了
然後 那个手麦田的稻草人
就上当又上当的讲了又讲
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.92.152
1F：→ RickyKckao:你要P的序列是GC rich吗? 可能你换的enzyme的buffer没 08/28 15:03
2F：→ RickyKckao:办法解高GC 08/28 15:03
3F：→ RickyKckao:比比看两个enzyme跟buffer的差异 说不定有蛛丝马迹@@ 08/28 15:04
4F：推 crazybrian:High fidelity对於sample DNA浓度有差! 浓度不能太高 08/28 16:08
5F：推 huuban:Tm56蛮低的，看你template是什麽吧 08/28 16:20
6F：→ huuban:不同酵素要参考protocol，说不定它适合hot start? 08/28 16:21
7F：→ huuban:也说不定它适合更高的Tm值，我们用的习惯都是58-60度 08/28 16:22
8F：推 Realthugz:都设计在60度附近+1 08/28 16:43
9F：推 lyu0001:tm 可以到66度都还ok 只要Primer够长 08/29 00:50
10F：推 lyu0001:加长primer应该比较有帮助 08/29 00:55
11F：→ Ianthegood:primer影响最大 新primer我都先拉gradient 50-65 08/29 03:27
12F：→ kikixie:谢谢大家我再试试看>< 08/29 14:29
13F：推 DJHINN:95 度 10 min @"@? 是哪一家的啊 我 hot start 都 5 min 08/31 15:51
14F：→ DJHINN:而已， 10 min 酵素还OK吗 XDD 08/31 15:52
15F：→ WinnieDad:我的hot start也是需要10分钟，并非不常见吧。一轮30几 08/31 22:26
16F：→ WinnieDad:cycles的PCR跑下来，少说也需要两个小时，Taq衰退也是比 08/31 22:27
17F：→ WinnieDad:较後期的事。一开始95度C多五分钟有差吗？毕竟每个厂牌 08/31 22:28
18F：→ WinnieDad:的hot start polymerase制程不同，依原厂说明时间即可。 08/31 22:29