※ 引述《mkmai0802 (Wengda)》之铭言： : 教授不给我买kit T.T : 只好拿实验室有的东西来Try Try 看 ~ : Polymerase 方面的问题 : : 一般的Taq - : 会在尾端多加一个A 好像不能用 而且会产生更多突变 ! : NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase - : 这个可以用吗 ? 我很怕他会把single-strand primer 切掉 ~ : 我有上它网站查 只有写说 会产生 Blunt-ended product ! : 也俱有3’→ 5’ exonuclease 活性 ! 但没有写到会不会把Primer切掉 ~ : Pfu Turbo High-Fidelity DNA Polymerase - : 想买这个来用 ~ kit 也用这种的 ~ 具有上述的优点 !! : 所以想知道 NEB的那株Polymerase能不能拿来用 !! : DpnI方面 - 不一定要用吧 ?? 可能就麻烦多定序几颗 ? 是这样吗 ? : 还是大大在做的时候还是会习惯 要加入这个步骤 比较省事 !!?? : Competent cell - 实验室只有DH5alpa : DH5alpa 是否也具有将 nicks 修补的功能 !! : 烦请熟练的大大分享一下心得 ~ : 感谢 !! 其实 我都没有用kit做的 用的都是一般的PCR方式 只要几条primer就好了 举例来说 ------GGCCAATtTAAGCTT------ 中间t要换成c 只需要合两条primer 分别是 5'GGCCAATcTAAGCTT3' ------GGCCAATtTAAGCTT------ 3'CCGGTTAgATTCGAA5' 再分别与外面的primer做PCR =======c==============================primerR primerF=================g======= 这时候 跑胶回收之後 再分别以这PCR product作为primer和template 进行5-10 cycle PCR之後 再加入外面的primerF和primerR进行一般的PCR即可 通常我的primerF和primerR都是Vector上的 当然 如果有适合的cutting site 只需要一条primer就足够 同样以上面为例子 ------GGCCAATtTAAGCTT------ 在预置换的nt附近刚好有一个HindIII cutting site 这时候只需要合一条primer PCR之後用HindIII切即可 =========================总结分隔线========================== 这方法成功与否 一般取决於primer的设计 如果只是要置换1-2个nt 一般的primer长度就够了 如果要换多个nt primer的长度要增长 而且PCR跑胶回收之後要进行下次PCR时 我都会先定量 使其molar ratio大概1:1 根据我的经验会大大提高合并起来的成功率 希望对您有帮助 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.129.9