作者mkmai0802 (Wengda)
看板Biotech
标题Re: [求救] 用kit抽plasmids
时间Fri Feb 24 22:34:04 2012
※ 引述《mkmai0802 (Wengda)》之铭言：
: 各位大大您好
: 小弟最近将一个基因接到一个plasmid载体上後 !
: 转型到DH5-alpha内, 涂盘挑single colony !
: 再O/N培养, 之後取 2.5 ml 的菌液用kit抽plasmids ~
: 用厂商的elution buffer回溶 100 ul ! 也用这 elution buffer 当Blank !
: 测出来的浓度约是50-100 ng/ul ,
: 之後再分四管 , 每管约150ng plasmids
: (1) 用EcoRI+HindIII切两刀
: (2) 用EcoRI切一刀
: (3) 用HindIII切一刀
: (4) 都没切
: 再去跑1%的Agarose gel !
: 问题来了 第1-3的位置都比 4的位置(下面)小一点
: 因为切开了 所以长度比较正确 ! (这应该没问题)
: 问题在於1 , 一没有出现 我想要的band !
: 老师说可能是我算错浓度 ! 浓度太高 所以切不动 = = !
: 所以想问问 抽出来的plasmids 这样的浓度合理吗 ?
: 他叫我 要放到 3-4 ug ! 可是我抽出来的量 没那麽多啊 ><
针对大大的问题 我在写详细一点好了 !
我那个gene的cDNA有再用他Start codon 和 stop codon地方再设计一组primer !
头加上EcoRI的切位,尾加上HindIII的切位 !
用Taq加上有proofreading的polymerase 10:1的量去PCR !
跑胶 也确实有约3K的band ! (我的基因cDNA约3K)
之後 利用 invitrogen TOPO PCR 2.1 的 TA vector接上 !
就大约会产上约 7K的 plasmids !
然後transform到DH5-alpha内
这时候有用cDNA的primer去做colony PCR !
确实有很强的band ! (做两次 一组用约500bp 另一组用全长去PCR)
确定有後 我挑single colony去O/N !
再抽plasmids !
可是要切的时候就发生一些问题 !!
所以想先请问大大 ~
我的plasmids 浓度合理吗 ? 太稀吗 ?
还想请问大大 !
跑胶要有band 大概要放多少ng的plasmids !
按照我浓度算出来 我100ng 就有band了(还蛮强的) !
我们老师说不可能 ! 要放到 1-5个ug !?
所以我怀疑我浓度有问题 >"<
我的RE是用 Biolabs EcoRI-HF HindIII-HF
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我爱你 用生命的爱 ~
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◆ From: 203.64.80.74
1F：推 mesenchymal:浓度50-100 ng/ul差不多 02/24 23:18
2F：推 mesenchymal:至於用跑胶粗估浓度的话,就对照marker的band亮度比吧 02/24 23:21
4F：→ mesenchymal:可以的话可以放上跑胶图给大家看看状况? 02/24 23:23
5F：→ blence:理论上第2,3组应该比4还高,你却看到相反的结果,想必你忽略 02/25 00:28
6F：→ blence:pCR2.1上也各有EcoRI及HindIII切点,才导致1,2,3组结果相同 02/25 00:30
7F：推 jabari:同楼上pcr2.1ta接位往前往後6bp就是EcoR1切位 02/25 01:52
8F：推 jabari:另外w-digestion的buffer正确吗??改用序列切割呢?? 02/25 01:54
9F：推 dodomilk:请问你跑(1)(2)(3)(4)的gel有对照marker看吗？ 02/25 03:11
10F：→ dodomilk:理论上(1)和(2)(3)的pattern应该完全不同喔！ 02/25 03:12
11F：推 icome:跑胶极限大概10ng 100ng很OK啊.. 02/25 17:55
12F：→ Realthugz:你知道一般marker最亮那条也才几十ng/ul左右而已吗 02/25 18:23
13F：→ Realthugz:RE跑胶 PCR跑胶 放大绝====>定序 02/25 18:24
14F：推 qiet:你们老师在搞笑吧 到ug基本上都超亮 但你放的浓度应该也OK 02/25 23:29
15F：→ lail:其实我觉得作TA很容易发生怪事(自己的经验).TA是我的最後选择 02/27 14:01
16F：推 joseph103331:如果你是用150ng的plasmid去跑 那你的片段切下来大约 02/28 09:57
17F：→ joseph103331:只有其中的3/7 也就是约64ng 可以考虑切久一点? 02/28 09:59
18F：→ jimmyshen17:跑胶100ng很够了~~RE切多久阿?? 02/28 22:52