作者shienn (西恩)
看板Biotech
标题[问题] real-time pcr
时间Wed Aug 10 22:22:46 2011
新手上路看了一下原理想问
real-time PCR只要看melting curve就可知道P出来的产物有没有单一
为什麽不用再跑胶确认长度呢?
难道不会有单一melting curve 但却P出不是预期的产物吗???
(如primer夹出来的单一产物 长度(序列)不是我们要的)
还有real-time PCR的好处
是不是就只在於可以随时监测PCR产物量的多寡
还是还有其他的好处@@?
像一般PCR
直接订个30 cycle之类 丢在那边就跑去做其他事
得到的结果不是一样吗?
反正PCR不是只是要放大片段 确认此序列的存在???
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
1F：推 aggaci:谁说不用跑的? 有人甚至还拿去定序哩 不用每次跑是真的 08/10 23:49
呃... 学长说real time都是用量化数据来判断@@
像是melting curve 所以不跑电泳
但不解的是不跑电泳怎麽知道扩出来的长度符合期望呢?
(结果他也不知道 就说反正看melting curve有单一产物就好)
像一般的PCR不都是跑出来长度以後 再拿去定序
2F：推 Realthugz:不一样吧 有不是每个sample丢30 cycle就解决了 08/11 00:27
对 我的意思是 目的是要放大片段
有必要随时监控产量吗?
3F：→ soom:如果产物很多，在30 cycle前就饱和，你要怎麽判断谁多谁少？ 08/11 08:25
4F：→ soom:如果是要做定量的话，real-time PCR就非常重要了 08/11 08:30
5F：→ soom:但如果只是要看有/没有表现的话，那一般PCR就够了 08/11 08:30
原来如此 就是说有些实验定量很重要...感谢解答~
6F：推 tigernaxo:我以前跑完realtime都会跑胶看看... 08/11 09:58
所以realtime也是跟普通PCR一样 无法确认产物内容@@?
7F：→ Ianthegood:realtime不是拿来看有没有的 08/11 14:47
8F：→ Ianthegood:primer跟program都会先设计过 目的就是在定量 08/11 14:48
嗯 所以就是注重在过程
但最後不用确认序列(定序)吗@.@?
就好像我们用普通的PCR 有时候虽然跑出预期长度
但最後送去定序结果没夹到预期的序列
※ 编辑: shienn 来自: 140.112.52.225 (08/11 16:34)
9F：推 Realthugz:主要就是soom版友说的那样 爆表的话大家看起来没差异 08/11 17:02
10F：→ Ianthegood:就说realtime的primer都要设计成很专一 不会夹到别的 08/11 17:51
11F：→ Ianthegood:东西 不会有其他band这样 08/11 17:52
12F：推 lucidol:melting curve可以看出专一性,但一般比较仔细的实验跑完 08/18 14:32
13F：→ lucidol:real-time之 後会跑胶与之对照,就可以排除你的问题所在 08/18 14:33
14F：→ kemmy:你应该先去了解为什麽要做 real time PCR 08/20 12:25
15F：→ kemmy:还有什麽是 real time PCR 08/20 12:25
16F：→ kemmy:看你的问题就知道你对基本的原理不清楚 08/20 12:26