作者BLACKOA (OA)
看板Biotech
标题[求救] 如何做悬浮性细胞的免疫萤光染色?
时间Thu Apr 21 17:16:11 2011
请问大家一个问题.
假若养悬浮性的细胞 (例如自然杀手细胞,NK cell)
如何把这样的悬浮性细胞固定在cover slip上之後,然後做IF(免疫染色)
我们有试过将NK cell贴在poly-lysine coated cover slip (BD)
直接把NK cell加在poly-lysine coated cover slip上,5小时
然後细胞的确会黏上去 (但会ㄧ团一团)
之後照以下步骤去做IF,如下:
1. 用prewarmed PBS洗2次
2. 以3.7% Formalin固定15min
3. 以PBS (含0.2% Triton X-100)打洞,5min x 3次
4. 以blocking buffer (PBS+5% BSA)室温blocking 1hr
5. 1抗 (1:50 diluted in blocking buffer),室温1-2hr (或 4度C overnight)
6. 以PBS洗,5min x 3次
7. 2抗 (Cy3-labeled anti-rabbit IgG, 1:100稀释),室温45min-1hr
8. 以PBS洗,5min x 3次
9. 然後以正立萤光显微镜观察
奇怪的是:
1. 细胞都会ㄧ团,然後在显微镜下看都没有焦距
2. 背景有点脏 (有点红或有点绿)
3. 细胞内的目标物都看不到 (我们是在看Perforin)
不晓得根据以上的步骤,可能会是什麽原因呢?
以及,不知道大家都怎麽做悬浮性细胞的IF呢?(都是:贴附-固定-染色吗?)
希望有人可以帮忙解答
谢谢
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1F：→ chvkimo:cytospin 可以吗? 04/21 18:14
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