作者sweetE (sweetE)
看板Biotech
标题Re: [求救] 请问lentivius的问题~~十万火急~~毕业困难
时间Sat Mar 27 21:23:38 2010
※ 引述《longko (观音兵)》之铭言：
: 板上各位好
: 最近~~我开始使用lentivirus 系统~~我从中研院订购了几组shRNA~~再lentivirus前
: 先将几组shRNA利用transfection的方式将plasmid送到HEK-293T细胞，做knockdown
: 照理来说，会在western blot测试中，看到目标蛋白被抑制，可是几次结果下来，
: 并未看出差异。
: 我是使用invitrogen的Lipofectamine 2000将plasmid送入细胞，48小时候收蛋白，
^^^^^^^^^^^^^^
: 过程中并无筛许，只有对照pEGFP-plasmid做为control。
: 而这几组shRNA中研院的测试结果都是有效的，所以在我pre-test的结果来看，该己
: 组shRNA就没有效果，请问各位前辈我有没有忽略什麽细节或少考虑了什麽。
你transfect哪些plasmid到293T细胞里做PACKAGE?
pCMV delta8.91 + pMD.G + 你从中研院买的表现shRNA的plasmid
是这样吧?
所以你transfect 48小时之後 应该是收病毒吧? 不是收蛋白吧!
and 经验谈 通常transfect 36小时的病毒titer是最高的, 24h或48h的病毒量都较少
然後你PACKAGE好病毒之後 感染的步骤也很重要
感染时所加的病毒浓度, 时间 都会影响
目前我试的GENE, 在病毒感染三天後,mRNA会下降,
但是protein要至少四五天才会显着knockdown
给你参考一下罗!
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◆ From: 59.115.101.148
1F：→ longko:谢谢兄台~~我这就试试看~~~ 03/28 14:43