因为最近要帮老师做专题遇到了一些问题... 有蛮多不懂的地方想请教一下板友 就是该实验最後要用real time PCR 去定量看gene的表现量 而事前要将抽RNA後转成cDNA 再拿cDNA去做real time 我们实验室是用Trizol去抽... 照理说抽出来的应该是细胞内所有的RNA (包含mRNA rRNA) 而後用OligodT去转cDNA ←应该是所有细胞中的mRNA都会被转成cDNA对吧? 之後就将cDNA拿去用待测gene的primer去夹用PCR放大 因为目前还不知道要挑哪些gene出来测 所以我们BOSS是说 先把RNA抽出送去做PCR array再从中挑几个用real time去检测是否符合 我们BOSS说每个浓度只要做一管转成cDNA就好 之後的real time都可以用那管去做 我的疑问是...今天待测基因约有5个 而且要做3重复 如果都从那管有整个细胞的mRNA转成的cDNA取出 应该会不够 那如果要将该管cDNA用PCR放大 那primer要怎麽办? 因为你不知道那管cDNA的组成 那你要怎麽去放大全部的片段? 还有一个问题...就是我可以先把加药处理完的细胞都抽RNA转成cDNA 那以後就可以不用再养细胞 而只要从那管cDNA去做就好 这样吗 ?? 这是第一次做PCR所以有很都不懂的地方...请大家帮忙看一下是否观念有错 谢谢^^ -- ◤ ▂◎▅◎▂ ◆◆ ▲▲ ◥ ◢◤◥◥ ◣ ◆◆ ◢◥◤◥◣ ◣东方project系列 ▋＞ ＜◢▋ ◆◆ ▋◣ ◢ ▍ ￣￣￣￣￣￣￣ ▌▄▄▄◤▎ ◆◆ ◆◆ ◥◣▄▄▄◢◤ 持续推广ing ▼| |▼ ◆◆ ◥ ￣██>◥◤ ◣ ▲▆▲ 少女受虐中... ◆◆ ◤ ▼◥ ψ凉宫 域 gbwind ◢ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 114.39.3.19 ※ 编辑: wayne841503 来自: 114.39.3.19 (01/30 00:18) 刚刚去看了些资料还是有些地方不太懂 关於这实验的设计是用同样浓度的药物不同的处理时间 来看药物对细胞的伤害 有做了2hr 12hr 24hr三个时间点 每个时间点都有一个negative control 要去看不同的处理时间中 所选出的5个基因表现量是否与PCR array的趋势相同 就拿2hr的来说好了...一管是有加药 另一管是没加药 拿加药那管来看 去抽RNA 所抽出来的不是total RNA吗? 之後再用oligodT去转cDNA 所转出的应该是total mRNA吧? 也就是说那管cDNA中包含着 1.因药物处理导致A gene表现产生的mRNA (先把待测gene当成A) 所反转成的cDNA 2.原本就存在的mRNA 经反转成的cDNA 是这样吗?? 如果是的话...因为到时候可能要测到5个gene 我是怕先前抽的mRNA转成cDNA後那管的量不够用来测5个gene 之後是设计A gene的primer 拿去跑real time 用sybr green 去测A gene与housekeeping的表现量 来做相对定量 在去比较有加药与未加药两管中 A gene是否有明显上升这边还有个疑问...刚刚去查了 RT-PCR 它可以把mRNA转成cDNA ←但这不是ssDNA吗? 还有protocal上 RT-PCR不像一般的PCR有denature→annealing→elongation 循环放大 那该不会一条A gene所产生的mRNA 只会转成1条cDNA吧? 2条mRNA就转出2条cDNA 那这样的cDNA数不就等於你当时加下去RT-PCR前的mRNA量? 这边看了protocal与资料後还是不懂... 如果是这样的话我抽出RNA的total浓度约2ug/ul 260/280=1.93 共约30ul而已(每管) 那之後转成cDNA不就也是那些量而已? 也就是说我到时候要养到5盘cell 转5管cDNA 再分别拿去跑real time测各gene表现量这 样吗? ←BOSS跟我说只要每个时间点抽一管就可以测5个 但我不太懂他的意思 我一直觉得一管才20~30ul又要做到5个gene会不够 麻烦帮我看一下...是不是我有想错哪部分或是哪部分观念有误 目前一直卡在这边转不过=口= 拜托了> < ※ 编辑: wayne841503 来自: 114.39.10.71 (01/30 16:11) ※ 编辑: wayne841503 来自: 114.39.10.71 (01/30 16:12)