作者genius012 (过了1/2个大学生活...)
看板Biotech
标题[求救] cloning做好多次,表现蛋白一直不对
时间Sun Oct 5 00:02:42 2008
cloning 已经做好多次了,表现蛋白都很奇怪,想请问一下各位大大
我的insert大概是900bp ,primer上有Hind III和Bgl II的切位
我PCR後跑胶的位置是正确的
我的vector大约为4200bp左右主要是之前学长做过的
上有pEGFP,用来表现有萤光的蛋白
也用HindIII和BglII(是一起切的)
跑胶後位置也是正确的,切胶纯化後(insert和vector的浓度为1ug/ml)
ligation做两组(用T4 DNA ligase--->16度C overnight)
用1:1和1:2(想说两者浓度相当接近,加上分子量关系)--->不知道是否比例不对
1:1-->总体积是25ul, 1:2总体积是35ul(ligase都加0.5ul)
transformation 後两个比例都有长(正控有长)
但是奇怪的出现--->有两种菌长出(一种有表现但较淡,另一种相当绿)
拿去做蛋白诱导後,(主要是希望诱导出insert接上EGFP蛋白)
较绿的菌表现的蛋白相当接近EGFP蛋白的分子 量(29kD)
另一个绿色颜色较淡表现的蛋白竟然相近原来做vector的plasmid(pEGFP-N230)
都没有预期的蛋白分子 量
这样是表示切胶没切好吗? ligation效率很差?
可是做很多次,蛋白表现都怪怪的...好诡异
拜托了
在transformation後的两个表现的菌种,有去抽其质体DNA,
并用HindIII和BglII切过
绿色萤光蛋白较强的跑出的DNA经限制每作用後有大概在4000bp左右
且是两个微弱的band,
但另一个绿萤光蛋白表现较弱的经限制每作用後跑的位置与当初plasmid用限制每
切过後的两个band差不多(4000bp与700bp附近)
因为学长希望再确认一些再拿去定序,
目前是专题生...
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 59.127.205.99
1F：推 huhu126:难道不能在诱导前先check你的clone是否正确,无法定序的话, 10/05 00:40
2F：→ huhu126:至少做个PCR check transformation之後的colony再去诱导吧 10/05 00:44
※ 编辑: genius012 来自: 59.127.205.99 (10/05 02:22)
3F：推 blence:如果上述流程都对,而强绿的size也无误,由於GFP在N,请确认它 10/05 03:01
4F：推 blence:in-frame没问题,另外弱绿size不对的话代表vector没切好,调 10/05 03:04
5F：→ blence:整RE或另加CIP解决(以上假定你的RE site数,位置无误) 10/05 03:06
6F：→ genius012:请问CIP是甚麽? 没有加过.... 10/07 00:18
7F：推 Crow22312:Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) 10/08 21:58