※ 引述《xp1000 (acraft)》之铭言： : 小弟不是前辈 但是我有不同的看法 : 不冗述 但就leondemon所提到的SyBr Green方式 : 一般在萤光侦测上 似乎一直为人诟病 : 相对於Taqman 它的三重复似乎更应该跟您朋友的方式一样那样做 : 取萤光侦测平均值减少3well之间的误差 : 在统计上的意义 : 小弟个人浅以为 : 执着於同一个体上基因的实验三重复性的重要性 : 远不及在多个个体取样後得到具再现的实验结果 : 假设针对实验个体上某基因因特别因素而造成的表现改变 : 使用您朋友的方式应该效率是较高的 : 因为若要在cDNA or RNA上取sample所可能造成起始浓度的问题上计较 : 那麽在更前面阶段的分光光度计侦测就可能造成整体浓度计算的误差了 : 根本的吊诡在於 您的实验组与对照组 承担一样的取样时的误差风险 : 但是小弟绝不是否定您的方式 : 若能在个体三重复上 及多个体的再现取得的统计意义 : 肯定是更不能否定的数据 十分谢谢X大的回应 我也呈述一下我的看法 在我的原来文章中 并没有提及「统计」这个领域 事实上 统计本来就是需要大量的「样本」去减少误差 (样本当然越多越好) 但是我所叙述的「三重复」 并不是去用「统计」去看待 而是用「分析化学」的角度 因为我们正在讨论的 是「一个个体(individual)的测量」 而非一个样本(sample)的分析 统计学上 由於族群(population)代表着实际情况 但我们不可能针对整个族群做研究 (想想看地球上有多少人类 怎麽可能为了一个人类实验 而为每个人都做测量) 因此有了样本(sample)的观念 目的就是希望能够用少部分的数量去代表整个族群 当然取样(sampling)的好坏 就会直接影响这个「样本」是否真实反应原始的「族群」 而「样本」中 每个基本组成单位 叫做个体(individual) 我们会针对每个「个体」去测量我们要的结果 讲到这里 我要先说声抱歉 在我原本的文章中 并没有清楚的表示我说的是一个「个体」 (似乎在我原始的文章 是讲「一个sample」 若造成误会 请见谅) 因此我要表明的一件事情 我们今天是针对一个「样本」中的「个体」做三重复 当然也是可以用到统计的概念 去针对这三次的结果做判读 但是我认为这实属分析化学的域畴 因为我们今天做real-time PCR 目的就是要赋予这个「个体」一个「量化」的结果 因此最重要的 我们侧量它 就必须考虑到测量的「精确度」和「准确度」 当给予每个「个体」产生一些「量化的结果」後 我们才会针对这个「族群」的所有个体 进行统计上的分析 去看有没有差异 但是 各位是否有考虑过 针对每个「个体」进行的测量结果 是不是就是反应这个「个体」的状态呢????? 因此我说三重复是分析化学的领域 就是这个道理 当你只取一次出来做实验 虽然是取三倍量 并分装至3个well中去测量 这样是提高了精确度 这并没有错~ 但是你却忽略的最重要的一点－－你并没有说明「准确度」 事实上，准确度想当然是比精确度来得重要许多 不然你测量的在怎麽精准 但却不准确 也是枉然 以统计的数据来说 常常会看到的数据如: A±B A指的是平均 B通常指标准差 而在分析化学中 A的意义就是准确度 而B的意义就是精确度 试想 一个5公分的笔 用一把尺去测量三次 结果得到的结果是4.00 4.01 4.02 假设将结果记成 4.01±0.01 但是用同样一只笔 却是用三把不同的尺去测量 结果得到4.6 5.0 5.2 假设将结果记成 4.9±0.3 由上面的结果 第一种测量方法的确「很精准」 每次测出来的结果都很一致 但是「准确度」呢??? 已经错得太离谱了 而第二种的测量方法 精确度的确不是很高 但是「准确度」绝对是比第一种好太多 我只能说 一个测不准的方法或仪器 即使在精密也没用 我们看结果 通常是先看前面的数据 也就是平均值 也就是代表着准确度 接下来才去看它的精确度 如果本末倒置 那科学的意义何在?? 今天我说的三重复 就是要避免刚刚例子中「拿错误的一把尺，做多次测试」 试想 你只针对reagent做一次抽取 要如何表示你结果的准确度呢?????? 如果这次你使用的tip有问题 如果你这次pipetting有问题 如果不小心抽到些微的气泡导致取样的体积不准确.... 太多太多的如果了 分生实验 根本看不太到你现在tube中有哪些成分 多少体积 若是把reagent包装外面的标签撕掉 我想根本没多少人能够从一群未知reagent中去做PCR 又不是像动物实验 大的用眼睛一眼就看得出来颜色、大小、位置....之类的状态描述 那「分子阶级」的东西 你怎麽有把握 你做的就没问题?? 你要怎麽确认?? 这就是我所认为的「三重复」存在的意义 我只是针对X大所提的观点做回应 事实上 我并不同意X大的观点 而不论是Taqman或是SYBR green方法 我认为都是一致 而X大所提及分光光度计一事 我只能说那就是internal control必须存在的意义 最後要说的 一个实验的测量 若是仪器部分的误差 那就是人为无法避免的 事实上 一个仪器的精确度和准确度 应该是该仪器所「必须」具备的 照理来说 我们应该做同一个实验都使用相同的仪器 (如果有人想回:「既然要三重复，那应该用不同的仪器去做测量。」 那我就不想跟你瞎起哄 因为我说过了 一台仪器的精确度和准确度 是该仪器所必须具备的) 然而人为的误差 这就是实验者应该去避免 并且该去证实的 那........何谓「三重复」? --

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