我们实验室是做蛋白质结构的 想分享一下从老师那里和自己的实验心得 ^^ [如果不符合版规请版主不用客气^^"] ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之铭言： : ※ 引述《ronall (昵称小公主的!扣十分先)》之铭言： : 稍微修饰一下 文章会更完美 : : 就我所知的说一夏 : : 我是化学所的生化组 : : 我做的是蛋白研究 : : 理论上而言 : : 我尽可能希望获的蛋白的NMR图谱 : : 因为NMR适用於水溶液的环境 : : 对於bio而言 : : 这点是非常重要的关键 : : 因为仅有在这样的条件下 : : 才能说是看见蛋白在生物体中的真实结构 : 首先 没有一个很严谨的结构生物学家会那麽肯定说他所解出的结构 : 就是生物体中的真实结构 : 无论是 X-ray, NMR, EM 都是在in vitro 的条件 : 且各有其严苛的条件下所做出的结构 : 这些离生物环境都很远 : 做cell bio 或 biochem 的人也很少说他们做的就是为 in vivo的真实情况 完全同意 t 大 过去的确也有 paper 比较在 X-ray 和 EM 下的结构的确有差异 可以发现某些蛋白质堆叠的面的结构受到压缩 水溶液环境下 NMR 的结构的确有可能较接近生理条件 但是也有很多 paper 会引用蛋白质结晶仍具有其活性的 data 来证明其结构的真实性 [我想到的是 lysozyme XD] 所以诚如 t 大所言 没有一个被解出的结构可以说就是真实的结构 [测量就会有误差嘛 (笑)] 不过毕竟这些结构不是人亲眼所见 科学家只能用其他实验方法佐证实验结果的正确性 : : 而X-Ray : : 在检测前有个前提 : : 就是必须养晶 : : 无论是哪种蛋白 : : 通常在养晶时必须加入一些重金属作为晶核 : : 或是与蛋白敖合形成晶种 : : 即便有不加入重金属而养晶的方式 : : 都无法比NMR方式肯定的说 : : 这是在生物体中较为真实的存在结构 : : 但NMR检测也是有缺点的 : : 就是必须相较於X-Ray而言 : : 必须要有相当程度的浓度才能检测 : X-ray 所须浓度与 NMR 所须浓度是 case by case : 都不低 难比谁高谁不高 X-ray 解析结构受限於养晶 [泪推~~~~~] 不过养晶的过程中就算需要加入重金属也不是要作为晶核 如果想要解出结构的蛋白质已经有类似的结构被解出 在得到绕射点数据後可以利用一些软体 (CCP4) 以 MR 的方式解出 如果是完全没有类似结构 就会需要利用重金属当作参考 (啊好复杂@@) 有的时候也会利用 Se-Met 所以不一定会需要使用重金属 至於浓度上的问题 t 大说的真是令人感动 @@ 真是 case by case 不过如果可以准备多点蛋白质 均质一点 可以得到较好的结果 : : 而通常 : : 我们尽可能使用N label (N同位素标定)的方式检测 : : 但是硬是要养出被同位素标记的蛋白通常都是不容易的 : : 因为是属於强迫性的方式供给菌种极为少量的养分 : : 迫使菌种吸收同位素生产蛋白 : : 因此产率通常都很低 : : 此外 : : 蛋白是种大型分子 : : 因此通常低磁场的NMR图谱是不能看的 : : 在我的实验室中 : : 都是送到我学校的NMR 600MHz 贵仪中心进行2D NMR检测 : : (国内学校单位有这样的机型的不多见) : 国内 800MHz 就 NCHU 与 GRC 吧 : : 而X-Ray在样品的制作上是容易的许多 : ......................... 嗯.... r.d.s 不一样吧? 在之前还没有实战经验的时候 我一直以为 纯化蛋白质是最痛苦的 @@ 後来发现养晶更是一种煎熬 @@ 然後有机会上机的时候又发现 就算晶长出来了 绕射点也不见得好 [烂烂的绕射点俯拾即是 Orz] 所以我觉得这也是 case by case 解析结构真是门艺术 @@ : : 解析通常也不错 : : 但是唯一为人所诟病的就是 : : 这样的结构并不是存在於水溶液环境底下的 : protein crystallization 并非是不含水的 : 蛋白质晶体晶格中常含有 30~70% 水分子 : 只是有些 PDB file 中省略掉了 : 甚至可以说蛋白质结晶是固像的水溶液的 : 没有水的蛋白质结构不大可能是正确的 : peptide 一定跟水有某方面的作用力 : 是否为水溶液并非 X-ray 问题的核心 : 真正有问题的 : 当然有时蛋白质结晶在较严苛环境下 (如高盐, 较极端 pH 质...等等) : 结构可能与生理有些出入-----------* : 但只要有结构 仍有其参考度的存在 : 此外 常常有 map 不见的情况发生 : 这些 map 不见的区域也常为蛋白质有其 function 重要的区块 : 当然 dynamic 状态 information 不足也为其 X-ray 结晶学的重要缺点 : 当然还有很多很多问题 就不一一说明 : *注 : 这句话也为一个伄诡 既然没人能说何为生理环境的真实面貌 : 当然也只能以现有 data 为解释 不能同意 t 大更多 也正如我前面提到的 这个部份也是结构生物学家争论不已的 不过也因为提出过实验数据 证明就算是结晶状态下的蛋白质仍具有活性 但也不能否认 r 大所说的 不是水溶液下的确很令人诟病 只是 X-ray 结构解出的时候 如果完全没有水分子那这个结构大概也不可信吧 不过 PDB file 中并没有省略掉水分子 只是用来开启 PDB file 的软体有没有显示出来 不然直接使用记事本开启 PDB file 档的时候 一定可以看到水分子的空间位置座标 而 t 大提到真正的问题 我想其实可以在拿到结晶的时候省视一下结晶条件 或是在筛选养晶条件是会略过过於严苛的环境 这样都可以提高所得到 X-ray 结构的可信度 map 看不见 常是因为该区的 flexibility 太高 如果说是酵素的 active site 则常会使用 substrate 的 analog 来稳定过渡结构 或是做一些 point mutation 来改善 虽然说还有很多很多的问题 不过就像 t 大所说的 无法一一说明 或许这也是我们该回答的问题 XD : - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - : 早期认为若把所有生物分子结构解出来 : 生物学就到底了 : 其实很多问题的开端 正是等结构解出来了後才又蹦出一堆来 : 生物分子的交互作用 四级结构的变化 post-translational modification : 条控 等一堆都还要各领域的投入 : 结构只是工具 : - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - : 还有 即便是结构的 paper , 也不要全信 paper 内所提的所有论点 : 虽说做结构的人会说眼见为评 : 但同一个结构 不同的解释有时会差的天差地远的 : 光我们自己发表的结构 内部就有不同的意见 : 这些很多在文中都不会说的 同意 t 大的说法 解出一个结构通常都会花掉的都是很多很多的钱 如果把分子结构解出来就当成一个结束实在是很可惜 应该好好利用其他的实验方法 将这些结构的结果用以参考 结构只是辅助 不是个终点~~ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 做结构的人越来越多了~~ 不知道可不可以开个版来分享一些实验心得?? 台湾有很不错的 NSRRC 的光源可以利用 真希望可以有更多有经验的人分享实验心得~~~ -- 寻找在程式中片刻的宁静... 我愿能将心灵沈淀 结晶... 让晶体一点一点散发淡淡的浓纯香郁... 送给单纯的你 祝福 找到属於自己最原始的爱恋... --

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