※ 引述《ronall (昵称小公主的!扣十分先)》之铭言： : 抱歉 : 小弟又来请教各位了 : 小弟纯化蛋白後 : 发现蛋白有aggregation的现象 : 我担心这会影响我的蛋白产率 : 所以想使用Urea去deaggregation : 之後想使用透析的方式除去Urea : 我想问的是 : refolding回来且为正确结构的蛋白能有多少? : 因为我有问过我家的博士後 : 他跟我说别将urea处理後的蛋白混在正常结构的蛋白中 : 他认为refolding的结构不确定正确与否 : 必须经由CD去监定 : 不知各位有什麽样的想法呢? 通常会加一些chemical chaperon去帮助folding 如glycerol，我记得古早的PNAS有针对这一点发了一篇article refoldingㄧ定会有一些沉淀，沉淀可能是folding错误所造成 但是soluble的部份也不全然是folding正确的 (denature通常是会打断双硫键和氢键，若是ㄧ个蛋白质可以形成4个双硫键， 排列组合一下你就知道有多少种组合) 所以这时就去测它的活性，或是用以之特性去证实 (如A和B可以结合，那就用IP的方法去证实) 当然少部分人是用CD去看，CD只看二级结构，所以不全然可信 与其一直卡在这里，我觉得就先确定是否有活性 有的话就直接往下做了，别去管里头有多少比例是"正确的"protein : ==========================细节说明讨论发起线================================== : 先感谢各位大大的回应 : 包含前面用水球丢了我好几次的大大 : 我想就我的想法说明好了 : 确实 : 当"产量"够的时候 : (产量定义为足够我进行实验的用量) : 我确实是不需在乎aggregation的部分 : 但是当我产量不够的时候 : 我必须额外再生产一批 : (不含等待的纯工作天约14天) : 因此小弟在评估从沉淀中将aggregation作denature并使其refolding : 这样的方式在时间上以及程序上是否比较有利? : 然 : 我的实验室并没有人做过这样的实验 : 我想问的是 : 博士後认为我必须将urea处理的沉淀 : 与上清液的正常蛋白分开处理 : 因为他觉得refolding miss的机会很大 : 所以认为我必须分开处理後再以CD或其他方式去监定结构 很正确 : 但我认为 : 我知道refolding miss的机会存在 : 但也不能否定正常foding蛋白的存在 : 同时 : 我实验用的蛋白其Apo-,Holo-两种构型仅有些许不同 : PI值分别为3.2, 3.3 : PI值差距这麽小的情况下能够以Q-sepharose分离 : 那麽 : folding miss的蛋白我认为应该也能够被分离 : 既然能被分离 : 那为何我还必须独立处理这个部分呢? : 这个部分是我最想知道的 : 感谢各位罗^_^ 你的意思是不分离沉淀的部份吗？ -- http://www.wretch.cc/album/aggaci --

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