请问一下您的蛋白质分子量是多少? 基本上大於100 kDa的protein在E. coli内的表现就会比较不好 另外真核membrane protein可能会有一些修饰作用, 在E. coli内无法进行而有毒性 Membrane protein也很容易形成inclusion body 如果先不考虑技术层面的因素 我个人的建议是 1. 选用E. coli C41 可耐受较强的蛋白质毒性 2. 换用yeast expression system, 尤其是大分子量的真核细胞膜蛋白 3. 选用分子量较大的tagged-fusion protein system (like INTEIN) 因为分子量够大, 可以破坏蛋白质的构形, 容易避免毒性和inclusion body ※ 引述《content71 (罗莉饲养中...)》之铭言： : 先对原PO说声不好意思，借用你的标题 : 因为我也遇到induction的问题急着想找人帮忙 : 我的状况是 : vector : 真核human membrane protein接入pET28a (His-tag) : E. coli strain : BL21(DE3) : BL21(DE3)pLysS : Rosetta(DE3) : induction : E. coli OD600 ~0.4 : 0.5mM, 1mM, for 37度C, 3hr : result --> BL21(DE3) 在induction後就不太生长，SDS-PAGE check无表现 : BL21(DE3)pLysS 在induction後会继续长，但SDS-PAGE check无表现 : western check在uninduce及induce都有表现但很少,leakage? : Rosetta(DE3) transformation後就没出现colonies了 (试过两次) : 我自己的推测是 : 此protein对E.coli有强毒性，所以一但induction菌就会挂掉或不生长 : 现在想到的是 1. 降温induction延长时间 : 2. 换Rosetta(DE3)pLysS (但我们老师肯定不会买...太了解他orz) : 3. 换表现菌种 : 4. 大量培养，硬是纯化 (最後的办法，算过大概需3 miligram) : 怎麽办阿....我快哭出来了 --

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