作者Reflection11 (反思自省很困難)
看板nCoV2019
標題[討論]簡介一般快篩原理與ELISA
時間Tue Feb 18 17:13:05 2020
RT-qPCR為目前認可的唯一檢測方法，大概的原理猴子那篇文也介紹了，雖然靈敏度
和偵測極限都很優秀，但畢竟檢測負荷量有限，未來疫情擴大發展為社區感染
不可能第一時間都做，需要發展快速檢測及快篩
首先先來介紹一下 甚麼是抗體 (Antibody, Ab)和抗原 (Antigen, Ag):
當身體有非我族類的外物進到身體 (病原體或花粉塵蟎之類的過敏原等..)
這些東西被免疫系統認為是種抗原
並會產生對抗這種抗原的專一性抗體,可以結合上抗原的表位 (epitope)把它給清除掉
https://imgur.com/T4FzHbi
(
https://tinyurl.com/sjr9jjl)
一個抗原可能有很多種表位，所以會產生數種結合不同表位的抗體
第一次碰到的抗原，身體得要花4~7天產生初步的抗體
這個抗體是 IgM,過一段時間後(數個禮拜)， IgM逐漸減少，經類型轉換及親和力成熟轉為
分泌 IgG/IgE/IgA
IgG是人體最主要的抗體、 IgE和過敏有關、 IgA可以附著於黏膜(呼吸道,腸道)
中和病原體、毒素等物質。
https://imgur.com/E9gyzJs
(
https://tinyurl.com/seh7adl)
當下一次遇到同樣的抗原,可以快速產生 IgG清除感染。
甚麼是ELISA?
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)最簡單的描述就是
利用抗原/抗體之間的專一性結合反應來得知結果，有分為幾種形式
這次先介紹常用的
https://imgur.com/2f0Feub
(
https://tinyurl.com/syg24ed)
a. Sandwitch ELISA
主要用來檢測抗原,以 HIV為例:
(1) 先在檢測用的孔盤上固定抗 HIV的抗體 (Anti-HIV Ab,上圖紫色)
(2) 加入檢體 (血液)，如果裡面有HIV (藍色圓形),則會和 Anti-HIV Ab結合
(3) 洗掉沒結合的，加入另一種 Anti-HIV Ab (從其他動物產生的,這裡以鼠為例,黃色)
(4) 洗掉沒結合的，加入抗鼠抗體(抗黃色的,藍色)的抗體 (從羊產生的)，不過這個
抗體上加了一種酵素 (HRP, 綠色)
(5) 洗掉沒結合的，加入酵素的受質 (Substrate如 TMB, ABTS),受質會被酵素切割產生產物
之後檢測產物就知道結果了
b. Indirect ELISA
主要用來檢測抗體,還是以 HIV為例:
(1) 孔盤上固定 HIV的抗原(上圖藍色)，並加入檢體(血液)
(2) 如果檢體裡有 抗HIV的抗體 (黃色)，則會結合上 HIV的抗原
(3) 洗去未結合的，加入抗人抗體的抗體 (二級抗體,從其他動物產生,藍色)，這抗體有
酵素 (HRP)
(4) 同a.
跟PCR比較:
優點: 檢測量更高(高通量)、比較便宜
缺點: 靈敏度較低，在疾病早期病毒量不高或尚未產生抗體時易偽陰性(測不到)
以 HIV來說，目前的第四代 EIA (ELISA, CMIA)為 Ag/Ab combo
同時檢測 HIV的抗原 (p24)以及抗體 (Anit-TMP Ab)，陽性再以 WB做確認
空窗期(易檢測不到)縮短為 2~3周，但如果使用 RT-qPCR，則可縮短至 7~10天
大概介紹了 ELISA，再來介紹快篩:
快篩常看到的形式是快篩片/棒,除了可以檢測疾病外,驗孕棒也是相似的原理
快篩片所使用的技術叫 Lateral flow assay，是基於免疫色層分析法
(Immunochromatographic test, ICT)
原理其實同樣是抗原/抗體專一性結合反應
常用來檢測的疾病像是流感 (Nucleoprotein)、登革熱 (NS1)、HIV (Anti-HIV Ab)
這邊以登革快篩片做舉例，它可以檢測檢體中登革病毒產生的抗原 NS1
上面分為幾個部分:
a. Conjugate pad: Anti-NS1 Ab(鼠)-膠體金 (Colloidal gold)複合物
b. Test line: 另一種 Anti-NS1 Ab(鼠)
c. Control line: Anti-mouse IgG Ab (羊)
(1) 加入檢體(血液)，帶動 Anti-NS1 Ab前進，如果檢體有 NS1則會和它結合
(2) 移動至 Test line時，會和固定於此的另一種 Anti-NS1 Ab結合，形成
Ab-Ag-Ab 複合物， Test line出現調帶。
(3) 部分的 Anti-NS1 Ab繼續前進至 Control line，和固定於此的羊抗鼠 IgG的抗體
結合 (Anti-mouse IgG Ab)， Control line出現調帶，不論有無NS1，以確保套組正確。
https://imgur.com/GvCH0rF
https://tinyurl.com/rlyus6t
快篩的優點: 超快(30分鐘內)、簡單
缺點: 靈敏度是真的可憐，流感快篩大概只有 50~70%，也就是說有 30~50%機率
測不到 (偽陰性)，同樣的早期病毒量不高或是抗體尚未生成測不到
但畢竟是能快速、簡單且可以大量分配檢測的方法，發展還是必要的
另外我這邊想說一下對於 SARS-Cov-2檢測數次為陰性，之後才陽性以及異常潛伏期的看法
目前來看潛伏期多為 2~14天，通常不會超過6天，卻出現疑似超長潛伏期的患者
1. 操作/試劑問題: SARS-Cov-2是 RNA病毒，使用的 RT-qPCR會先進行 RT轉為 DNA
再進行 DNA擴增，但有做過的人都知道: RNA很怕 RNA水解酶(RNase)，而且
RNase everywhere，空氣中、人和物體表面隨處都有，只要操作清潔不注意不確實
你的樣品就88了，另外檢測套組 (試劑盒)也可能有問題，像是版上的這篇
https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/nCoV2019/M.1581566306.A.F11.html
2. 之後再感染: 其實我覺得這個可能性最高，一般感冒或流感發燒咳嗽很正常
你這時候去驗當然驗不出來，但在這段期間可能被傳染 SARS-Cov-2，過了一長段時間
再檢測測到了，就可以發一篇文說: 可怕狡猾的病毒!潛伏期長達90天，然後就受驚了
3. 這病毒真的很神秘: 這我就不曉得了，那得看後續的研究
總之大概就是這樣，在面臨未來可能無法避免的社區感染，病患多到負壓病房住不下
的危險情況下，希望檢測技術和抗病毒藥物發展能早日控制住疫情。
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※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/nCoV2019/M.1582017190.A.9BA.html
1F：推 s505015: Elisa也是要猜coat的量 和稀釋量140.109.113.176 02/18 17:21
2F：→ s505015: 我是不覺得比較簡單140.109.113.176 02/18 17:21
3F：→ s505015: 然後要確定antigen和antibody140.109.113.176 02/18 17:22
4F：推 youngblood: 現在大家才知道檢驗師的重要 59.125.65.169 02/18 17:22
5F：推 Kiyoda: 如果是我還是覺得RT 比較準確 140.112.59.176 02/18 17:24
6F：推 danms: 我有聽過Elsa 59.126.154.133 02/18 17:25
7F：→ batatas: 還有取樣問題 因為是下呼吸道感染為主 咽 223.136.87.141 02/18 17:26
8F：推 s505015: 洗完的手法也蠻重要的140.109.113.176 02/18 17:26
9F：→ batatas: 喉採樣要深一點 223.136.87.141 02/18 17:26
10F：→ Rinehot: 比起有機合成，我寧可選做生物實驗。114.136.172.176 02/18 17:26
11F：推 pppeko: 取樣很重要 不管後面用ELISA或PCR 再就是 59.124.7.148 02/18 17:32
12F：→ pppeko: 抗體的特異性不知夠不夠好 59.124.7.148 02/18 17:32
13F：→ pppeko: 個人覺得ELISA有時候結果也會模糊讓人困擾 59.124.7.148 02/18 17:32
14F：推 duriamon: 正確。現在靠PCR但是RNA病毒不穩定序列 223.137.252.29 02/18 17:47
15F：→ duriamon: 會有變化，必需一邊定序一邊修正primer 223.137.252.29 02/18 17:47
16F：→ duriamon: ，另外RNA樣品沒弄好，RNA被RNAse吃光光 223.137.252.29 02/18 17:47
17F：→ duriamon: 連驗都沒得驗。目前要等美國CDC驗證完才 223.137.252.29 02/18 17:47
18F：→ duriamon: 知道實際偽陽跟偽陰機率如何。按照這個 223.137.252.29 02/18 17:47
19F：→ duriamon: 病要反覆檢驗，沒快篩會操死醫檢人員。 223.137.252.29 02/18 17:47
20F：推 asdfg012345: 採撿問題啦，對岸猜很多喉頭採撿抹口 59.115.10.76 02/18 17:53
21F：→ asdfg012345: 腔就交差了 59.115.10.76 02/18 17:53
22F：推 arue: 檢測技術真的很複雜 以及很多問題不好克服 150.116.43.125 02/18 17:58
23F：→ arue: 但老百姓聽不進去這麼多 150.116.43.125 02/18 17:58
24F：推 hwider: 感謝分享解說！ 223.139.28.253 02/18 18:00
25F：推 zjin1126: 現在有新的CRISPR/Cas13的技術，可以快 39.11.166.27 02/18 18:02
26F：→ zjin1126: 篩病毒核酸，雖然沒有PCR靈敏但是應該 39.11.166.27 02/18 18:02
27F：→ zjin1126: 比起檢驗抗體或抗原來的敏感很多 39.11.166.27 02/18 18:02
29F：→ zjin1126: 之前在Zika跟dengu virus的應用算是成 39.11.166.27 02/18 18:04
30F：→ zjin1126: 功，應該是蠻有希望的快篩技術 39.11.166.27 02/18 18:04
31F：推 hitmd: 樓上的方法也還是要抽RNA,然後兩個溫度反應 112.105.53.218 02/18 18:09
32F：→ hitmd: 約要一個小時，其實跟rtqpcr的已經差不多久 112.105.53.218 02/18 18:09
33F：→ hitmd: 了，不過蠻新的方式，感謝分享 112.105.53.218 02/18 18:09
34F：推 pippen2002: 真得很神蜜啊!!? 203.75.79.118 02/18 18:53
35F：→ saimeitetsu: 大三的生物科技學的記憶 223.137.9.55 02/18 19:06
36F：→ saimeitetsu: 很吃操作人員的技術，太蔡的人操作 223.137.9.55 02/18 19:06
37F：→ saimeitetsu: 都會變成陰性XD 223.137.9.55 02/18 19:06
38F：推 cruby841031: 推 118.161.96.21 02/18 19:08
39F：推 kinomon: 推 42.74.141.75 02/18 19:34
40F：推 lidon00968: 天那 竟然要開課教生物技術 211.21.229.7 02/18 20:23
41F：推 cutie: 如果之後要開始檢查抗體的話是不是又要開223.137.132.237 02/18 20:34
42F：→ cutie: 始用westenblot之類的電泳來驗證蛋白質？223.137.132.237 02/18 20:34
43F：推 watase124: western 真的要弄很久 每步都是時間 1.169.198.15 02/18 20:45
44F：推 hyc0725zz: 樓下放迪士尼BGM（欸 180.11.145.171 02/18 20:52
45F：推 cutie: 但還是以pcr為主 如果後續陰性確定一餓檢223.137.132.237 02/18 21:16
46F：→ cutie: 查抗體可能才需要麻煩的western吧==223.137.132.237 02/18 21:16
47F：→ Amewakahiko: 這板簡直是讓科科的生科人透口氣 220.134.212.92 02/18 21:49
48F：推 chungrew: 幫推111.243.186.152 02/18 21:50
49F：→ archlich: 其實台灣應該是全世界檢驗能力密度最高 223.139.50.65 02/18 22:29
50F：→ archlich: 的國家，我們有一大堆生科相關的學生， 223.139.50.65 02/18 22:30
51F：→ archlich: PCR跟ELISA技術對相關學系的學生來說都 223.139.50.65 02/18 22:30
52F：→ archlich: 沒有難度，只要有儀器跟足夠的材料，所 223.139.50.65 02/18 22:30
53F：→ archlich: 有相關實驗室都可以投入檢驗 223.139.50.65 02/18 22:30
54F：推 mirror0227: 好文推 111.71.126.171 02/18 23:35
55F：推 hqu: 又上了一次生物技術 223.138.79.140 02/18 23:51
56F：推 boreas224: ELISA要把測試條件抓好要一段時間吧... 114.38.78.197 02/19 01:11
57F：→ boreas224: 有文獻有kit的 操作起來當然沒問題 114.38.78.197 02/19 01:13
58F：推 boreas224: Loading量、抗體結合時間、呈色時間 114.38.78.197 02/19 01:16
59F：→ boreas224: 而且上面也有提到，滿吃操作人員技術的 114.38.78.197 02/19 01:17
60F：推 boreas224: 流程看就是那樣，不過操作過程眉角很多 114.38.78.197 02/19 01:21
61F：推 t0ny: 推科普文 111.184.183.63 02/19 03:31
62F：→ t0ny: 其實醫學分生檢驗真的還蠻需要人的技術，以 111.184.183.63 02/19 03:32
63F：→ t0ny: 前遇過不少臨床醫師批評説醫檢師不是就把檢 111.184.183.63 02/19 03:32
64F：→ t0ny: 體放到機器上就好了嗎？有什麼難的 111.184.183.63 02/19 03:32
65F：→ Amewakahiko: 醫檢師公會會生氣哦 依醫事法及醫檢 220.134.212.92 02/19 06:46
66F：→ Amewakahiko: 師法規定 只有醫檢師才能進行臨床檢 220.134.212.92 02/19 06:46
67F：→ Amewakahiko: 驗 所以生科繼續科科 220.134.212.92 02/19 06:47
68F：→ watase124: 科科只能 for research only QQ 61.230.195.202 02/19 10:14
69F：→ pppeko: 檢查抗體就是這篇介紹的ELISA啊 不是weste 101.9.209.153 02/19 10:59
70F：→ pppeko: rn blot 101.9.209.153 02/19 11:00