作者Reflection11 (反思自省很困难)
看板nCoV2019
标题[讨论]简介一般快筛原理与ELISA
时间Tue Feb 18 17:13:05 2020
RT-qPCR为目前认可的唯一检测方法，大概的原理猴子那篇文也介绍了，虽然灵敏度
和侦测极限都很优秀，但毕竟检测负荷量有限，未来疫情扩大发展为社区感染
不可能第一时间都做，需要发展快速检测及快筛
首先先来介绍一下 甚麽是抗体 (Antibody, Ab)和抗原 (Antigen, Ag):
当身体有非我族类的外物进到身体 (病原体或花粉尘蟎之类的过敏原等..)
这些东西被免疫系统认为是种抗原
并会产生对抗这种抗原的专一性抗体,可以结合上抗原的表位 (epitope)把它给清除掉
https://imgur.com/T4FzHbi
(
https://tinyurl.com/sjr9jjl)
一个抗原可能有很多种表位，所以会产生数种结合不同表位的抗体
第一次碰到的抗原，身体得要花4~7天产生初步的抗体
这个抗体是 IgM,过一段时间後(数个礼拜)， IgM逐渐减少，经类型转换及亲和力成熟转为
分泌 IgG/IgE/IgA
IgG是人体最主要的抗体、 IgE和过敏有关、 IgA可以附着於黏膜(呼吸道,肠道)
中和病原体、毒素等物质。
https://imgur.com/E9gyzJs
(
https://tinyurl.com/seh7adl)
当下一次遇到同样的抗原,可以快速产生 IgG清除感染。
甚麽是ELISA?
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)最简单的描述就是
利用抗原/抗体之间的专一性结合反应来得知结果，有分为几种形式
这次先介绍常用的
https://imgur.com/2f0Feub
(
https://tinyurl.com/syg24ed)
a. Sandwitch ELISA
主要用来检测抗原,以 HIV为例:
(1) 先在检测用的孔盘上固定抗 HIV的抗体 (Anti-HIV Ab,上图紫色)
(2) 加入检体 (血液)，如果里面有HIV (蓝色圆形),则会和 Anti-HIV Ab结合
(3) 洗掉没结合的，加入另一种 Anti-HIV Ab (从其他动物产生的,这里以鼠为例,黄色)
(4) 洗掉没结合的，加入抗鼠抗体(抗黄色的,蓝色)的抗体 (从羊产生的)，不过这个
抗体上加了一种酵素 (HRP, 绿色)
(5) 洗掉没结合的，加入酵素的受质 (Substrate如 TMB, ABTS),受质会被酵素切割产生产物
之後检测产物就知道结果了
b. Indirect ELISA
主要用来检测抗体,还是以 HIV为例:
(1) 孔盘上固定 HIV的抗原(上图蓝色)，并加入检体(血液)
(2) 如果检体里有 抗HIV的抗体 (黄色)，则会结合上 HIV的抗原
(3) 洗去未结合的，加入抗人抗体的抗体 (二级抗体,从其他动物产生,蓝色)，这抗体有
酵素 (HRP)
(4) 同a.
跟PCR比较:
优点: 检测量更高(高通量)、比较便宜
缺点: 灵敏度较低，在疾病早期病毒量不高或尚未产生抗体时易伪阴性(测不到)
以 HIV来说，目前的第四代 EIA (ELISA, CMIA)为 Ag/Ab combo
同时检测 HIV的抗原 (p24)以及抗体 (Anit-TMP Ab)，阳性再以 WB做确认
空窗期(易检测不到)缩短为 2~3周，但如果使用 RT-qPCR，则可缩短至 7~10天
大概介绍了 ELISA，再来介绍快筛:
快筛常看到的形式是快筛片/棒,除了可以检测疾病外,验孕棒也是相似的原理
快筛片所使用的技术叫 Lateral flow assay，是基於免疫色层分析法
(Immunochromatographic test, ICT)
原理其实同样是抗原/抗体专一性结合反应
常用来检测的疾病像是流感 (Nucleoprotein)、登革热 (NS1)、HIV (Anti-HIV Ab)
这边以登革快筛片做举例，它可以检测检体中登革病毒产生的抗原 NS1
上面分为几个部分:
a. Conjugate pad: Anti-NS1 Ab(鼠)-胶体金 (Colloidal gold)复合物
b. Test line: 另一种 Anti-NS1 Ab(鼠)
c. Control line: Anti-mouse IgG Ab (羊)
(1) 加入检体(血液)，带动 Anti-NS1 Ab前进，如果检体有 NS1则会和它结合
(2) 移动至 Test line时，会和固定於此的另一种 Anti-NS1 Ab结合，形成
Ab-Ag-Ab 复合物， Test line出现调带。
(3) 部分的 Anti-NS1 Ab继续前进至 Control line，和固定於此的羊抗鼠 IgG的抗体
结合 (Anti-mouse IgG Ab)， Control line出现调带，不论有无NS1，以确保套组正确。
https://imgur.com/GvCH0rF
https://tinyurl.com/rlyus6t
快筛的优点: 超快(30分钟内)、简单
缺点: 灵敏度是真的可怜，流感快筛大概只有 50~70%，也就是说有 30~50%机率
测不到 (伪阴性)，同样的早期病毒量不高或是抗体尚未生成测不到
但毕竟是能快速、简单且可以大量分配检测的方法，发展还是必要的
另外我这边想说一下对於 SARS-Cov-2检测数次为阴性，之後才阳性以及异常潜伏期的看法
目前来看潜伏期多为 2~14天，通常不会超过6天，却出现疑似超长潜伏期的患者
1. 操作/试剂问题: SARS-Cov-2是 RNA病毒，使用的 RT-qPCR会先进行 RT转为 DNA
再进行 DNA扩增，但有做过的人都知道: RNA很怕 RNA水解酶(RNase)，而且
RNase everywhere，空气中、人和物体表面随处都有，只要操作清洁不注意不确实
你的样品就88了，另外检测套组 (试剂盒)也可能有问题，像是版上的这篇
https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/nCoV2019/M.1581566306.A.F11.html
2. 之後再感染: 其实我觉得这个可能性最高，一般感冒或流感发烧咳嗽很正常
你这时候去验当然验不出来，但在这段期间可能被传染 SARS-Cov-2，过了一长段时间
再检测测到了，就可以发一篇文说: 可怕狡猾的病毒!潜伏期长达90天，然後就受惊了
3. 这病毒真的很神秘: 这我就不晓得了，那得看後续的研究
总之大概就是这样，在面临未来可能无法避免的社区感染，病患多到负压病房住不下
的危险情况下，希望检测技术和抗病毒药物发展能早日控制住疫情。
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※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/nCoV2019/M.1582017190.A.9BA.html
1F：推 s505015: Elisa也是要猜coat的量 和稀释量140.109.113.176 02/18 17:21
2F：→ s505015: 我是不觉得比较简单140.109.113.176 02/18 17:21
3F：→ s505015: 然後要确定antigen和antibody140.109.113.176 02/18 17:22
4F：推 youngblood: 现在大家才知道检验师的重要 59.125.65.169 02/18 17:22
5F：推 Kiyoda: 如果是我还是觉得RT 比较准确 140.112.59.176 02/18 17:24
6F：推 danms: 我有听过Elsa 59.126.154.133 02/18 17:25
7F：→ batatas: 还有取样问题 因为是下呼吸道感染为主 咽 223.136.87.141 02/18 17:26
8F：推 s505015: 洗完的手法也蛮重要的140.109.113.176 02/18 17:26
9F：→ batatas: 喉采样要深一点 223.136.87.141 02/18 17:26
10F：→ Rinehot: 比起有机合成，我宁可选做生物实验。114.136.172.176 02/18 17:26
11F：推 pppeko: 取样很重要 不管後面用ELISA或PCR 再就是 59.124.7.148 02/18 17:32
12F：→ pppeko: 抗体的特异性不知够不够好 59.124.7.148 02/18 17:32
13F：→ pppeko: 个人觉得ELISA有时候结果也会模糊让人困扰 59.124.7.148 02/18 17:32
14F：推 duriamon: 正确。现在靠PCR但是RNA病毒不稳定序列 223.137.252.29 02/18 17:47
15F：→ duriamon: 会有变化，必需一边定序一边修正primer 223.137.252.29 02/18 17:47
16F：→ duriamon: ，另外RNA样品没弄好，RNA被RNAse吃光光 223.137.252.29 02/18 17:47
17F：→ duriamon: 连验都没得验。目前要等美国CDC验证完才 223.137.252.29 02/18 17:47
18F：→ duriamon: 知道实际伪阳跟伪阴机率如何。按照这个 223.137.252.29 02/18 17:47
19F：→ duriamon: 病要反覆检验，没快筛会操死医检人员。 223.137.252.29 02/18 17:47
20F：推 asdfg012345: 采捡问题啦，对岸猜很多喉头采捡抹口 59.115.10.76 02/18 17:53
21F：→ asdfg012345: 腔就交差了 59.115.10.76 02/18 17:53
22F：推 arue: 检测技术真的很复杂 以及很多问题不好克服 150.116.43.125 02/18 17:58
23F：→ arue: 但老百姓听不进去这麽多 150.116.43.125 02/18 17:58
24F：推 hwider: 感谢分享解说！ 223.139.28.253 02/18 18:00
25F：推 zjin1126: 现在有新的CRISPR/Cas13的技术，可以快 39.11.166.27 02/18 18:02
26F：→ zjin1126: 筛病毒核酸，虽然没有PCR灵敏但是应该 39.11.166.27 02/18 18:02
27F：→ zjin1126: 比起检验抗体或抗原来的敏感很多 39.11.166.27 02/18 18:02
29F：→ zjin1126: 之前在Zika跟dengu virus的应用算是成 39.11.166.27 02/18 18:04
30F：→ zjin1126: 功，应该是蛮有希望的快筛技术 39.11.166.27 02/18 18:04
31F：推 hitmd: 楼上的方法也还是要抽RNA,然後两个温度反应 112.105.53.218 02/18 18:09
32F：→ hitmd: 约要一个小时，其实跟rtqpcr的已经差不多久 112.105.53.218 02/18 18:09
33F：→ hitmd: 了，不过蛮新的方式，感谢分享 112.105.53.218 02/18 18:09
34F：推 pippen2002: 真得很神蜜啊!!? 203.75.79.118 02/18 18:53
35F：→ saimeitetsu: 大三的生物科技学的记忆 223.137.9.55 02/18 19:06
36F：→ saimeitetsu: 很吃操作人员的技术，太蔡的人操作 223.137.9.55 02/18 19:06
37F：→ saimeitetsu: 都会变成阴性XD 223.137.9.55 02/18 19:06
38F：推 cruby841031: 推 118.161.96.21 02/18 19:08
39F：推 kinomon: 推 42.74.141.75 02/18 19:34
40F：推 lidon00968: 天那 竟然要开课教生物技术 211.21.229.7 02/18 20:23
41F：推 cutie: 如果之後要开始检查抗体的话是不是又要开223.137.132.237 02/18 20:34
42F：→ cutie: 始用westenblot之类的电泳来验证蛋白质？223.137.132.237 02/18 20:34
43F：推 watase124: western 真的要弄很久 每步都是时间 1.169.198.15 02/18 20:45
44F：推 hyc0725zz: 楼下放迪士尼BGM（欸 180.11.145.171 02/18 20:52
45F：推 cutie: 但还是以pcr为主 如果後续阴性确定一饿检223.137.132.237 02/18 21:16
46F：→ cutie: 查抗体可能才需要麻烦的western吧==223.137.132.237 02/18 21:16
47F：→ Amewakahiko: 这板简直是让科科的生科人透口气 220.134.212.92 02/18 21:49
48F：推 chungrew: 帮推111.243.186.152 02/18 21:50
49F：→ archlich: 其实台湾应该是全世界检验能力密度最高 223.139.50.65 02/18 22:29
50F：→ archlich: 的国家，我们有一大堆生科相关的学生， 223.139.50.65 02/18 22:30
51F：→ archlich: PCR跟ELISA技术对相关学系的学生来说都 223.139.50.65 02/18 22:30
52F：→ archlich: 没有难度，只要有仪器跟足够的材料，所 223.139.50.65 02/18 22:30
53F：→ archlich: 有相关实验室都可以投入检验 223.139.50.65 02/18 22:30
54F：推 mirror0227: 好文推 111.71.126.171 02/18 23:35
55F：推 hqu: 又上了一次生物技术 223.138.79.140 02/18 23:51
56F：推 boreas224: ELISA要把测试条件抓好要一段时间吧... 114.38.78.197 02/19 01:11
57F：→ boreas224: 有文献有kit的 操作起来当然没问题 114.38.78.197 02/19 01:13
58F：推 boreas224: Loading量、抗体结合时间、呈色时间 114.38.78.197 02/19 01:16
59F：→ boreas224: 而且上面也有提到，满吃操作人员技术的 114.38.78.197 02/19 01:17
60F：推 boreas224: 流程看就是那样，不过操作过程眉角很多 114.38.78.197 02/19 01:21
61F：推 t0ny: 推科普文 111.184.183.63 02/19 03:31
62F：→ t0ny: 其实医学分生检验真的还蛮需要人的技术，以 111.184.183.63 02/19 03:32
63F：→ t0ny: 前遇过不少临床医师批评説医检师不是就把检 111.184.183.63 02/19 03:32
64F：→ t0ny: 体放到机器上就好了吗？有什麽难的 111.184.183.63 02/19 03:32
65F：→ Amewakahiko: 医检师公会会生气哦 依医事法及医检 220.134.212.92 02/19 06:46
66F：→ Amewakahiko: 师法规定 只有医检师才能进行临床检 220.134.212.92 02/19 06:46
67F：→ Amewakahiko: 验 所以生科继续科科 220.134.212.92 02/19 06:47
68F：→ watase124: 科科只能 for research only QQ 61.230.195.202 02/19 10:14
69F：→ pppeko: 检查抗体就是这篇介绍的ELISA啊 不是weste 101.9.209.153 02/19 10:59
70F：→ pppeko: rn blot 101.9.209.153 02/19 11:00