※ 引述《RoarING (創下我的經典)》之銘言： : ※ 引述《afa》之銘言： : : 作者: afa (我是可愛的馬鈴薯) 看板: NTUAC92 : : 標題: 大家看看吧 : : 時間: Sun Jan 11 01:09:08 2004 : : 作者: afa (我是可愛的馬鈴薯) 看板: NTUBST92 : : 標題: 通緝清河!! : : 時間: Sun Jan 11 01:02:25 2004 : : 抱歉..借用系版一下^^" : : --- : : 清河 假如你還在線上的話... : : 你可不可以幫我看一下這個.. : : ---- : : Direct sequencing的目的如下.. : : 為了要了解無法在實驗室中培養的細菌，利用此技術配合演化樹，尋找此種細菌 : : 與目前已知的哪些細菌相似.. : : [稍微翻一下而已啦..有一點錯的話不要太計較^^"] : : Direct sequencing的流程如下.. : : 1.從土壤或水中取sample : : 2.將細胞溶解&作DNA purify : : 3.用"廣泛的"(universe)rRNA基因的primer 將purify後的DNA作PCR : : 4.將PCR後的DNA purify後並分類 : : 5.將分類後的DNA分別注入E.Coli中 : : 6.待E.Coli大量繁殖後 取出plasmid再跑電泳 : : 問題如下.. : : 1.第4步時的purify是不是要將製造rRNA基因特別分離出來?不然為什麼要再purify一次..? : : [我真的忘了耶..PCR後要再作一次purify嗎?] : 我的想法阿 第二步的purify是把DNA跟其他細胞質的東西分離 yep! : 而在第四步的purify是分離出不同的片段 因為你在做PCR的時候 除了你的DNA之外 你還要放引子 聚合酉每...等東西 所以還是要purify一下啦.. [我之前完全忘了這件事情...||] 另外..分離出不同的片段 應該是用"電泳"來分離 : : 2.為什麼要特別將這段DNA放入E.Coli裡面??用意是什麼?? : : 假如只是要放大DNA的話..直接用PCR跑就好啦 跑多久就有多少.. : : 是因為PCR的錯誤率高?[好像有聽說過這件事..但是我不確定..>"<] : : 我想了很久耶..>"< 可是還是不會><" : 我記得...做PCR的時候 要放入人工的引子 才能開啟複製叉 進行複製 : 所以...PCR複製一遍的量 好像是有限的 就是一次只能複製你所給引子的量的DNA : 所以用PCR跑到一定量的DNA之後 再分離 放進大腸桿菌之後 : 大腸桿菌繁殖的速度很快 不用很久的時間就可以有很大一缸的DNA可以用了吧 : 嗯...這是我的猜測啦 哈哈 不知道對不對 嗯..大家對PCR的印象好像都覺得很複雜.. 可是其實不是這樣的喔~~ 你只要放入一定量的引子 然後對著機器調整你要的cycle數 等2-3hrs 結果就出來了! 可是你假如要對大腸桿菌作clone的話.. 是一件非常麻煩的事情...|| 你把DNA注入後 要先經過篩選[例如用抗生素] 然後呢..養菌給你養個半天好了.. 最後還要抽plasmid 我想最快要.........一天吧 可能不只.. 光時間就差很多 : : --- : : purify應該是一定要的..因為要把雜質弄掉..我後來才想起來.. : : [我們做完PCR應該有做purify吧..我真的忘了..||] : : 第二個問題呢..強者董認為PCR的確錯誤率比較高 : : 不知你有什麼看法?? : : --- : : 歡迎大家一起討論~~ : 不過我沒聽過說PCR錯誤率比較高這件事ㄝ..求証之後告訴我一聲好嗎 : 拜託啦 謝謝 多學一課 這個呢.. 在PCR的技術還沒有這麼成熟的時候 是真的!! 不過現在已經不會了啦~~ 至於我朋友去查資料的結果.. 簡單講就是,之所以去作clone,是因為不相信PCR的結果 所以將這兩個結果(只作PCR和clone)的sequencing結果作比對 結論是PCR可以信任,所以後來漸漸不作clone 只是我們的課本還是有這個步驟就是了.. -- I'm just a small potato. --

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