※ 引述《RoarING (创下我的经典)》之铭言： : ※ 引述《afa》之铭言： : : 作者: afa (我是可爱的马铃薯) 看板: NTUAC92 : : 标题: 大家看看吧 : : 时间: Sun Jan 11 01:09:08 2004 : : 作者: afa (我是可爱的马铃薯) 看板: NTUBST92 : : 标题: 通缉清河!! : : 时间: Sun Jan 11 01:02:25 2004 : : 抱歉..借用系版一下^^" : : --- : : 清河 假如你还在线上的话... : : 你可不可以帮我看一下这个.. : : ---- : : Direct sequencing的目的如下.. : : 为了要了解无法在实验室中培养的细菌，利用此技术配合演化树，寻找此种细菌 : : 与目前已知的哪些细菌相似.. : : [稍微翻一下而已啦..有一点错的话不要太计较^^"] : : Direct sequencing的流程如下.. : : 1.从土壤或水中取sample : : 2.将细胞溶解&作DNA purify : : 3.用"广泛的"(universe)rRNA基因的primer 将purify後的DNA作PCR : : 4.将PCR後的DNA purify後并分类 : : 5.将分类後的DNA分别注入E.Coli中 : : 6.待E.Coli大量繁殖後 取出plasmid再跑电泳 : : 问题如下.. : : 1.第4步时的purify是不是要将制造rRNA基因特别分离出来?不然为什麽要再purify一次..? : : [我真的忘了耶..PCR後要再作一次purify吗?] : 我的想法阿 第二步的purify是把DNA跟其他细胞质的东西分离 yep! : 而在第四步的purify是分离出不同的片段 因为你在做PCR的时候 除了你的DNA之外 你还要放引子 聚合酉每...等东西 所以还是要purify一下啦.. [我之前完全忘了这件事情...||] 另外..分离出不同的片段 应该是用"电泳"来分离 : : 2.为什麽要特别将这段DNA放入E.Coli里面??用意是什麽?? : : 假如只是要放大DNA的话..直接用PCR跑就好啦 跑多久就有多少.. : : 是因为PCR的错误率高?[好像有听说过这件事..但是我不确定..>"<] : : 我想了很久耶..>"< 可是还是不会><" : 我记得...做PCR的时候 要放入人工的引子 才能开启复制叉 进行复制 : 所以...PCR复制一遍的量 好像是有限的 就是一次只能复制你所给引子的量的DNA : 所以用PCR跑到一定量的DNA之後 再分离 放进大肠杆菌之後 : 大肠杆菌繁殖的速度很快 不用很久的时间就可以有很大一缸的DNA可以用了吧 : 嗯...这是我的猜测啦 哈哈 不知道对不对 嗯..大家对PCR的印象好像都觉得很复杂.. 可是其实不是这样的喔~~ 你只要放入一定量的引子 然後对着机器调整你要的cycle数 等2-3hrs 结果就出来了! 可是你假如要对大肠杆菌作clone的话.. 是一件非常麻烦的事情...|| 你把DNA注入後 要先经过筛选[例如用抗生素] 然後呢..养菌给你养个半天好了.. 最後还要抽plasmid 我想最快要.........一天吧 可能不只.. 光时间就差很多 : : --- : : purify应该是一定要的..因为要把杂质弄掉..我後来才想起来.. : : [我们做完PCR应该有做purify吧..我真的忘了..||] : : 第二个问题呢..强者董认为PCR的确错误率比较高 : : 不知你有什麽看法?? : : --- : : 欢迎大家一起讨论~~ : 不过我没听过说PCR错误率比较高这件事ㄝ..求证之後告诉我一声好吗 : 拜托啦 谢谢 多学一课 这个呢.. 在PCR的技术还没有这麽成熟的时候 是真的!! 不过现在已经不会了啦~~ 至於我朋友去查资料的结果.. 简单讲就是,之所以去作clone,是因为不相信PCR的结果 所以将这两个结果(只作PCR和clone)的sequencing结果作比对 结论是PCR可以信任,所以後来渐渐不作clone 只是我们的课本还是有这个步骤就是了.. -- I'm just a small potato. --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 203.203.62.27