作者ex20122 (林葳)
看板NDHU-LS103
標題[公告] 生物實驗 小量質體DNA製備 講義更新
時間Fri May 13 23:24:22 2011
小量質體DNA製備
目的：利用細菌的生理特性及藥物之處理，將E. coli 的菌體分解或打破，以分離及純化
出質體(plasmid) DNA。
原理：
此實驗為利用小量質體純化試劑組來抽取大腸桿菌質體DNA 之快速方法，以改良過的
鹼溶裂法打破細胞，並配合所選的吸附膜純化管組，從細菌中萃取質體DNA。
利用含SDS的鹼性溶液處理細胞。SDS可將細胞膜打破，而鹼會破壞DNA的氫鍵，導致
DNA變性(由雙股變為單股狀態)，再加入酸性溶液中和後，使單股回復為雙股DNA。在急速
中和反應中，染色體DNA因分子龐大鹼基匆忙配對形成一雜亂無序的巨大分子，對水的相
對溶解度低。相反的，質體DNA因分子小，兩單股恢復鹼基配對快而易溶於水中 ，故只要
經過離心，即可將染色體DNA與質體DNA分離。
再利用silica membrane的column來萃取上清液。因核酸在高鹽下質體DNA能與
silica membrane吸附在一起，而蛋白質、多醣類或脂質則無法吸附。利用含有酒精的
Wash buffer清洗silica，將殘留蛋白質、多醣類或脂質清洗。最後以低鹽溶液(水或TE
buffer)將核酸從silica 上清洗下來。
實驗器材：
含有質體的大腸桿菌E.coli (pCDH)
High-Speed plasmid mini kit
離心管
離心機
電泳裝置
實驗步驟：
1. 將培養好的菌液取1 .5ml於離心管中，以14000xg離心1分鐘，使液態培養基中的菌體
集中於管底，離心完後去除上清液。
2. 加入200μl的PD1 Buffer，以震盪器將沉澱的菌體打散至均勻混合。
3. 加入200μl的PD2 Buffer ，輕輕的上下反轉tube(約10次左右)，置於室溫3分鐘。
4. 加入300μl的PD3 Buffer ，輕輕的上下反轉tube(約10次左右)，以14000xg離心3分鐘
。
5. 將column插入collection tube中，將步驟4離心後的上清液倒入column，再以
14000xg離心1分鐘。
6. 將濾液移除後，再把column插回collection tube後加入400μL W1 Buffer於column
，之後以14000xg離心1分鐘。
7. 將濾液移除後，再把column插回collection tube後加入600μL Wash Buffer並以
14000xg離心1分鐘。
8. 將濾液再次除去後，再把column插回collection tube後以14000xg離心3分鐘。
9. 移除collection tube將column置於另一個新的離心管中，之後加入50μL的Elution
Buffer至column中靜置2分鐘後，以14000xg離心2分鐘。
10. 取DNA溶液跑電泳。
問題與討論：
1.請說明此實驗分離plasmid的方法如何將chromosomal DNA去除而保留plasmid DNA？
2.為何solution II加入後僅能將管子上下反轉而不可劇烈震盪呢?
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結報別寫錯囉~
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◆ From: 222.156.206.95
1F：→ clicker1986:真正在實驗室抽的話 有些步驟會不太一樣 05/13 23:34
2F：→ clicker1986:不僅可以改進抽出來的plasmid的品質 量也可以增多 05/13 23:35
3F：→ clicker1986:有興趣知道的可以私底下問我 ^_<* 05/13 23:36
4F：→ clicker1986: written by 常常一次同時抽24管小量的助教 囧 05/13 23:37
5F：推 mychile:謝謝威志跟助教詳細的講解^^ 05/14 01:45
6F：推 superwan:助教辛苦囉~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 05/15 08:53
7F：推 Minesweeper:謝啦 05/16 18:29
8F：推 jordan521:下巴讚!! 05/16 21:06