作者ex20122 (林葳)
看板NDHU-LS103
标题[公告] 生物实验 小量质体DNA制备 讲义更新
时间Fri May 13 23:24:22 2011
小量质体DNA制备
目的：利用细菌的生理特性及药物之处理，将E. coli 的菌体分解或打破，以分离及纯化
出质体(plasmid) DNA。
原理：
此实验为利用小量质体纯化试剂组来抽取大肠杆菌质体DNA 之快速方法，以改良过的
硷溶裂法打破细胞，并配合所选的吸附膜纯化管组，从细菌中萃取质体DNA。
利用含SDS的硷性溶液处理细胞。SDS可将细胞膜打破，而硷会破坏DNA的氢键，导致
DNA变性(由双股变为单股状态)，再加入酸性溶液中和後，使单股回复为双股DNA。在急速
中和反应中，染色体DNA因分子庞大硷基匆忙配对形成一杂乱无序的巨大分子，对水的相
对溶解度低。相反的，质体DNA因分子小，两单股恢复硷基配对快而易溶於水中 ，故只要
经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。
再利用silica membrane的column来萃取上清液。因核酸在高盐下质体DNA能与
silica membrane吸附在一起，而蛋白质、多醣类或脂质则无法吸附。利用含有酒精的
Wash buffer清洗silica，将残留蛋白质、多醣类或脂质清洗。最後以低盐溶液(水或TE
buffer)将核酸从silica 上清洗下来。
实验器材：
含有质体的大肠杆菌E.coli (pCDH)
High-Speed plasmid mini kit
离心管
离心机
电泳装置
实验步骤：
1. 将培养好的菌液取1 .5ml於离心管中，以14000xg离心1分钟，使液态培养基中的菌体
集中於管底，离心完後去除上清液。
2. 加入200μl的PD1 Buffer，以震荡器将沉淀的菌体打散至均匀混合。
3. 加入200μl的PD2 Buffer ，轻轻的上下反转tube(约10次左右)，置於室温3分钟。
4. 加入300μl的PD3 Buffer ，轻轻的上下反转tube(约10次左右)，以14000xg离心3分钟
。
5. 将column插入collection tube中，将步骤4离心後的上清液倒入column，再以
14000xg离心1分钟。
6. 将滤液移除後，再把column插回collection tube後加入400μL W1 Buffer於column
，之後以14000xg离心1分钟。
7. 将滤液移除後，再把column插回collection tube後加入600μL Wash Buffer并以
14000xg离心1分钟。
8. 将滤液再次除去後，再把column插回collection tube後以14000xg离心3分钟。
9. 移除collection tube将column置於另一个新的离心管中，之後加入50μL的Elution
Buffer至column中静置2分钟後，以14000xg离心2分钟。
10. 取DNA溶液跑电泳。
问题与讨论：
1.请说明此实验分离plasmid的方法如何将chromosomal DNA去除而保留plasmid DNA？
2.为何solution II加入後仅能将管子上下反转而不可剧烈震荡呢?
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1F：→ clicker1986:真正在实验室抽的话 有些步骤会不太一样 05/13 23:34
2F：→ clicker1986:不仅可以改进抽出来的plasmid的品质 量也可以增多 05/13 23:35
3F：→ clicker1986:有兴趣知道的可以私底下问我 ^_<* 05/13 23:36
4F：→ clicker1986: written by 常常一次同时抽24管小量的助教 囧 05/13 23:37
5F：推 mychile:谢谢威志跟助教详细的讲解^^ 05/14 01:45
6F：推 superwan:助教辛苦罗~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 05/15 08:53
7F：推 Minesweeper:谢啦 05/16 18:29
8F：推 jordan521:下巴赞!! 05/16 21:06