作者zeroking0519 (麵包)
看板NDHU-LS101
標題[課程] 分生實驗補充
時間Mon Apr 12 22:55:05 2010
因為...很多人來問我上禮拜實驗的事...
所以...我決定...當一次好人....
=================================正文開始=====================================
你們的分生課似乎正好在上到transcription，
那...
http://ppt.cc/P6~C 這是一些關於transcription的影片，可以自己去看看
還有.
http://ppt.cc/FOHG 這是Wiki說的transcription，還不錯詳細 (英文)
然後.
http://ppt.cc/AWRG 這是Wiki官於RNA polymerase的介紹 (英文)
其中.
http://ppt.cc/akqp 也有介紹T7 RNA polymerase的東西 (英文)
之中.
http://ppt.cc/oGNX 還有promoter這種東西也很重要 (英文)
So~自己去看，加油啦，閃人~~~~
==============================好了，就這樣囉==================================
想走! 快給我回來 ( ‵□′)───C＜─___-)|||
你不把事情交代清楚是不會讓你走的
<( ￣ㄧ￣)q▄︻═╤═─ \(￣□￣")/
)˙ ˙( (˙人˙ ) 是是是...我做，我做 ///Orz...
／ 凸 ＼ / \
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基本上張媽上課一定會講到 [Central Dogma]，
基本上就是訊息在分子間的傳遞，
在
http://biotech.nstm.gov.tw/03/032.asp 就說的很詳細不再贅述。
以DNA為模板做出RNA，這個步驟就叫做transcription。
而細胞中有數以萬計的基因因為不同的調控都在進行transcription，
這些以不同基因為模板做出來的RNA主要分為四大類
I. mRNA <=== 會再更近一步進行translation。
II. tRNA
III. rRNA
IV. siRNA
這四種RNA分別在細胞中扮演不同的角色。
而在真核生物的細胞中，mRNA還會進行轉錄後修飾(post transcriptional modification)
包含5'端 capping、3'端加上polyA tail，還有RNA的splicing。
若是我們把細胞中的total RNA萃取出來，RNA的成份就會很複雜。
包括了正在表現的mRNA和siRNA，還有恆常表現的tRNA和rRNA。
那total RNA究竟有什麼作用呢?
既然可以抽取到細胞目前所在表現的RNA，
科學家就可以利用這種方式去研究細胞在不同狀態下有哪些RNA的表現，
例如:正常細胞和癌細胞RNA表現的差異；
成人和幼兒RNA表現差異；
吸收藥物的細胞和沒給藥物的細胞RNA表現的差異，
.....................等等不同的實驗，你想到有差異的都可以試試看。
但是這種情況有一種缺點，如果今天小明想要單獨研究一段RNA的功能，
要叫他從total RNA中純化出單一他感興趣的RNA是完全不可能的。
所以小明就想到一個方法，
┌─────────────────┐
│先把那段基因clone到一個plasmid上，│
│ │
│把plasmid送到細菌裡面大量表現， │
│ │
│把plasmid純化出來， │
│ │
│加入RNA polymera做出需要的RNA!! │
└─────────────────┘
真是太完美了~~~來設計實驗吧!
恩..clone好簡單~我會，
transformation連大學生都會做阿
抽plasmid...太EASY了
恩...transcription...transcription...沒做過ㄝ =口= 快來去查資料
究竟transcription需要些什麼呢??
DNA ===> 有了 (就是前面準備的plasmid阿)
transcription最終的產物是RNA，所以需要RNA的單體，
也就是 ATP、UTP、CTP、GTP (<===為了稱呼上的方便，在這裡都全部統稱rNTP)
需要有RNA polymerase幫忙做出RNA。
那什麼RNA polymerase最方便阿??那選個噬菌體的RNA polymerase好了
(因為噬菌體是很簡單，已經被研究透徹了，EX:T3、T7、SP6)
好啦~~~都有囉，全部加再一起攪一攪。奇怪...RNA還是沒有出現ㄝ，問題出在哪?
原來做transcription的時候RNA polymerase需要辨認DNA上的promoter阿
(promoter這觀念有一點點難懂，基本上它是一段DNA sequence， )
(上面的特殊序列剛好可以讓RNA polymerase做binding，並啟動之後的transcription)
那就在plasmid上面多加入promoter，再把要表現的RNA接在promoter後面
無敵啦~~~一定成功!!
疑??這次雖然有做出RNA，但是RNA的屁股(3'端)卻多出了一些額外的RNA耶
這是怎麼一回事呢?
原來~~RNA在細胞裡面表現的時候，除了辨認promoter外，做到最後還會辨認terminator
不然一條DNA這麼長是要做到哪裡去阿 (汗)
可是還要在plasmid上面加入terminator會不會太麻煩了點......好討厭，想想別的辦法
有了!!
只要在我想要表現的蛋白質最後面設計一個限制酶切位把DNA切斷
RNA polymerase做到最後就掉下來啦!!
RNA也只做到屁屁，不會再多一些有的沒的啦 ~~\(^▽^)/~~
可是...RNA做完...裡面還有模板(DNA)和RNA polymerase耶
沒關係，加入DNase把DNA分解，
再用pheno/chroloroform/IAA分離出RNA，
最後用酒精把鹽類洗掉~~~
(最後的三個步驟花太多時間，就沒有給你們做了)
可喜可賀可喜可賀，小明終於可以研究他的RNA了。
※後記:小明真的是這世界上最衰，最聰明，也最蠢的人了。
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夭壽...打一個半小時，不知道這種呈現方式會不會讓你們比較暸解實驗在做什麼，
包括簡單的原理和目的。
有不懂得話...我最前面PO的連結稍微看一下也可能會暸解多一點，
真的完全不懂的話就來實驗室吧。
有什麼問題或是想要討論的也可以直接推文討論唄
PS:究竟會不會有人被最前面的大空白婊到，然後髒話連連 XD
PS:這花了我ㄧ個半小時...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.44.202.82
1F：→ zeroking0519:說時話還是有點亂@@ 畢竟能講的東西真的是太多了 04/12 22:56
2F：→ zeroking0519:好想知到有誰被騙到 04/12 23:17
3F：推 peterdffr:大推~~ 好險沒被騙(習慣看到最後果然是好事~)!! 04/12 23:18
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4F：推 Steven911:感人熱淚的一篇好文章! 很可憐的小明的鼓掌了(泣) 04/13 20:29
5F：推 yphpolarbear:推阿~~~~辛苦帥氣的麵包! 04/13 21:41
6F：推 aabbccbbaa:推~~~~~~ 04/13 22:12
7F：→ zeroking0519:恩...這邊考了10.5分... 04/13 22:37
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11F：→ raok:這花了我5分鐘觀看 04/14 08:54
12F：推 taro1204:麵包是大好人....XD 04/14 19:24
13F：推 wind90257:路過推麵包很威!!!!!!!! 04/15 07:51