作者zeroking0519 (面包)
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标题[课程] 分生实验补充
时间Mon Apr 12 22:55:05 2010
因为...很多人来问我上礼拜实验的事...
所以...我决定...当一次好人....
=================================正文开始=====================================
你们的分生课似乎正好在上到transcription，
那...
http://ppt.cc/P6~C 这是一些关於transcription的影片，可以自己去看看
还有.
http://ppt.cc/FOHG 这是Wiki说的transcription，还不错详细 (英文)
然後.
http://ppt.cc/AWRG 这是Wiki官於RNA polymerase的介绍 (英文)
其中.
http://ppt.cc/akqp 也有介绍T7 RNA polymerase的东西 (英文)
之中.
http://ppt.cc/oGNX 还有promoter这种东西也很重要 (英文)
So~自己去看，加油啦，闪人~~~~
==============================好了，就这样罗==================================
想走! 快给我回来 ( ‵□′)───C＜─___-)|||
你不把事情交代清楚是不会让你走的
<( ￣ㄧ￣)q▄︻═╤═─ \(￣□￣")/
)˙ ˙( (˙人˙ ) 是是是...我做，我做 ///Orz...
／ 凸 ＼ / \
==============================================================================
基本上张妈上课一定会讲到 [Central Dogma]，
基本上就是讯息在分子间的传递，
在
http://biotech.nstm.gov.tw/03/032.asp 就说的很详细不再赘述。
以DNA为模板做出RNA，这个步骤就叫做transcription。
而细胞中有数以万计的基因因为不同的调控都在进行transcription，
这些以不同基因为模板做出来的RNA主要分为四大类
I. mRNA <=== 会再更近一步进行translation。
II. tRNA
III. rRNA
IV. siRNA
这四种RNA分别在细胞中扮演不同的角色。
而在真核生物的细胞中，mRNA还会进行转录後修饰(post transcriptional modification)
包含5'端 capping、3'端加上polyA tail，还有RNA的splicing。
若是我们把细胞中的total RNA萃取出来，RNA的成份就会很复杂。
包括了正在表现的mRNA和siRNA，还有恒常表现的tRNA和rRNA。
那total RNA究竟有什麽作用呢?
既然可以抽取到细胞目前所在表现的RNA，
科学家就可以利用这种方式去研究细胞在不同状态下有哪些RNA的表现，
例如:正常细胞和癌细胞RNA表现的差异；
成人和幼儿RNA表现差异；
吸收药物的细胞和没给药物的细胞RNA表现的差异，
.....................等等不同的实验，你想到有差异的都可以试试看。
但是这种情况有一种缺点，如果今天小明想要单独研究一段RNA的功能，
要叫他从total RNA中纯化出单一他感兴趣的RNA是完全不可能的。
所以小明就想到一个方法，
┌─────────────────┐
│先把那段基因clone到一个plasmid上，│
│ │
│把plasmid送到细菌里面大量表现， │
│ │
│把plasmid纯化出来， │
│ │
│加入RNA polymera做出需要的RNA!! │
└─────────────────┘
真是太完美了~~~来设计实验吧!
恩..clone好简单~我会，
transformation连大学生都会做阿
抽plasmid...太EASY了
恩...transcription...transcription...没做过ㄝ =口= 快来去查资料
究竟transcription需要些什麽呢??
DNA ===> 有了 (就是前面准备的plasmid阿)
transcription最终的产物是RNA，所以需要RNA的单体，
也就是 ATP、UTP、CTP、GTP (<===为了称呼上的方便，在这里都全部统称rNTP)
需要有RNA polymerase帮忙做出RNA。
那什麽RNA polymerase最方便阿??那选个噬菌体的RNA polymerase好了
(因为噬菌体是很简单，已经被研究透彻了，EX:T3、T7、SP6)
好啦~~~都有罗，全部加再一起搅一搅。奇怪...RNA还是没有出现ㄝ，问题出在哪?
原来做transcription的时候RNA polymerase需要辨认DNA上的promoter阿
(promoter这观念有一点点难懂，基本上它是一段DNA sequence， )
(上面的特殊序列刚好可以让RNA polymerase做binding，并启动之後的transcription)
那就在plasmid上面多加入promoter，再把要表现的RNA接在promoter後面
无敌啦~~~一定成功!!
疑??这次虽然有做出RNA，但是RNA的屁股(3'端)却多出了一些额外的RNA耶
这是怎麽一回事呢?
原来~~RNA在细胞里面表现的时候，除了辨认promoter外，做到最後还会辨认terminator
不然一条DNA这麽长是要做到哪里去阿 (汗)
可是还要在plasmid上面加入terminator会不会太麻烦了点......好讨厌，想想别的办法
有了!!
只要在我想要表现的蛋白质最後面设计一个限制酶切位把DNA切断
RNA polymerase做到最後就掉下来啦!!
RNA也只做到屁屁，不会再多一些有的没的啦 ~~\(^▽^)/~~
可是...RNA做完...里面还有模板(DNA)和RNA polymerase耶
没关系，加入DNase把DNA分解，
再用pheno/chroloroform/IAA分离出RNA，
最後用酒精把盐类洗掉~~~
(最後的三个步骤花太多时间，就没有给你们做了)
可喜可贺可喜可贺，小明终於可以研究他的RNA了。
※後记:小明真的是这世界上最衰，最聪明，也最蠢的人了。
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夭寿...打一个半小时，不知道这种呈现方式会不会让你们比较了解实验在做什麽，
包括简单的原理和目的。
有不懂得话...我最前面PO的连结稍微看一下也可能会了解多一点，
真的完全不懂的话就来实验室吧。
有什麽问题或是想要讨论的也可以直接推文讨论呗
PS:究竟会不会有人被最前面的大空白婊到，然後脏话连连 XD
PS:这花了我ㄧ个半小时...
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.44.202.82
1F：→ zeroking0519:说时话还是有点乱@@ 毕竟能讲的东西真的是太多了 04/12 22:56
2F：→ zeroking0519:好想知到有谁被骗到 04/12 23:17
3F：推 peterdffr:大推~~ 好险没被骗(习惯看到最後果然是好事~)!! 04/12 23:18
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※ 编辑: zeroking0519 来自: 134.208.25.145 (04/13 11:31)
4F：推 Steven911:感人热泪的一篇好文章! 很可怜的小明的鼓掌了(泣) 04/13 20:29
5F：推 yphpolarbear:推阿~~~~辛苦帅气的面包! 04/13 21:41
6F：推 aabbccbbaa:推~~~~~~ 04/13 22:12
7F：→ zeroking0519:恩...这边考了10.5分... 04/13 22:37
8F：→ Steven911:10.5...... 04/14 00:17
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