http://bdl.nease.net/Magzine/OtherPapers/cell%20fuse%20with%20B%20cell%20&%20hybridize%20tumour.htm 基本原理 分泌抗體的激活B細胞與骨髓瘤細胞融合，才能生成具有親體細胞兩方面特性即既可產生 抗體又可在體外無限繁殖的雜交瘤細胞，因此，細胞融合是單克隆抗體制備的中心環節。 細胞融合的方法多採用化學助融法，最常用的化學助融劑為聚乙二醇（Polyethylene glycol、PEG），分子量100-4000的PEG助融效果最好，對細胞的毒性相對小。此外，還可 利用電融合等物理方法，在親本細胞的情況西很有適宜採用。本節介紹化學融合方法。抗 體分泌細胞是由免疫動物（小鼠或大鼠）的脾臟或淋巴結制備，與骨髓瘤細胞混合，並用 PEG使之融合。5-15天後，僅雜交瘤開始在選擇培養基（見前）中生長。其後測定雜交瘤 分泌的特異抗體，一旦選出合用的陽性細胞，則進行克隆，亞克隆及凍存。 試劑及儀器 一般設備見前； l 培養基A：RPMI1640 + 2mmol/L 谷氨酰胺+ 1mmol/L丙酮酸鈉+ 1 mmol/L非必 需氨基酸+青黴素100U/ml、鏈黴素100 μg/ml（有的實驗室也加入10%NCTC109 培養基） l 培養基B：培養基A +3% FCS （見後說明） l 培養基C：培養基A + 1× HAT + 20% FCS（500ml） l 50 × HAT液或粉劑（有商品） l PEG1500 （有商品，可即用） l 1mol/L硫酸銅液 l 17mol/L NH4Cl 水溶液（消毒，用於紅細胞溶解） l 培養皿（直徑100或60mm） l 細胞粗濾器（篩孔：40 μm ） 操作步驟 一． 脾細胞及骨髓瘤細胞制備 由小鼠分離的脾細胞作為抗體生成細胞的方法已有多種介紹。在許多實驗室應用的 操作方案僅稍有不同。淋巴結也可用為B細胞的來源。骨髓瘤細胞必須培養至少一周，要 求在融合日要達到對數生長期。所有的實驗操作均需在消毒條件下進行。 （一）脾細胞制備 1．分離取出脾臟，置於含7ml培養基B的培養皿中（在動物房進行），將培養皿移入垂直 氣流的通風櫥中； 2．將脾臟移入另一含7ml培養基A的培養皿中，用鑷子撕開脾臟，使大多數脾細胞釋出； 3．用吸管吹打細胞團塊，將混合液移入50ml聚丙乙烯管中，4℃沉降5min； 4．將細胞懸液移入另一50ml聚丙乙烯管， 200 × g 離心7min，棄上清； 5．用冰冷的0.17mol/L NH4Cl 水溶液（2-3ml/ 每個脾臟）懸起沉澱，在室溫下培養 5-10 min，以溶解紅細胞，然後緩慢加入45ml培養基A； 6．200 × g 離心7min，棄上清； 7．沉澱再懸入10ml 培養基A中。 （二）骨髓瘤細胞的制備 1．在對數生長期收穫107-108的骨髓瘤細胞； 2．200 × g 離心7min，棄上清； 3．輕輕震動試管以鬆動沉澱，將細胞懸於20ml 培養基A中； 4．200 × g 離心7min，棄上清； 5．細胞懸於10 ml 培養基A中，取適量進行細胞計數； 6．200 × g 離心7min，棄上清； 7．沉澱再懸於10 ml 培養基A中。 二．細胞融合 1．以2：1混合脾細胞與骨髓瘤細胞； 2．加入培養基A到25ml； 3．在室溫下，200 × g 離心7min，棄上清； 4．輕輕震動試管使鬆動沉澱，後置入37℃水浴； 5．用1000μl的加樣器，緩慢（超過1min）逐滴加入700μl經37℃預溫的PEG1500，並用 吸頭攪拌； 6．經過1 min後，緩慢（超過3min）加入5ml培養基A； 7．再過1 min ，加入7ml 37℃預溫的培養基A； 8．隔1 min，再加入7ml 37℃預溫的培養基A（以達逐步稀釋）； 9．室溫下，200 × g 離心10min，棄上清； 10．再將沉澱小心地懸浮於培養基C，使細胞終濃度為1 × 106 脾細胞/ml； 11．在已加100 μl培養基C/孔的2-3塊96孔板中，再加入100 μl/ 孔細胞懸液； 12．置入含5-8%CO2的37℃培養箱中； 13．一周後，每孔吸出100 μl上清，再加入100 μl培養基C，繼續每週換液1-2次； 14．後續操作見以下實驗後述。 實驗要點及說明 1．可用DMEM (4.5 g/l葡萄糖) 代替RPMI (2 g/l葡萄糖)； 2．B細胞與骨髓瘤細胞之比也可為1：1或1：1.5； 3．細胞融合操作是關鍵步驟，要避免以吸管用力吸打； 4．在細胞融合後2-3天，要注意檢測是否污染；黴菌在培養箱中污染速度迅速。一旦發現 污染，盡快棄出污染的培養皿； 5．在細胞融合後4-5天後，在顯微鏡觀察可見到克隆。某些克隆可能在融合後7-8天才可 見到； 6．在確定已得到對抗原有明顯的滴度的抗體及篩選條件已最佳化前，不要開始細胞融合 實驗。 參考文獻 1． Fazekas,de St Groth. And Scheidegger、D. (1980) Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Meth. 35,1-21. 2． Galfre、G. And Milstein、C. (1981) Preparation of monoclonal antibodies: strategy and procedures. Meth. Enzymol. 73、part B、3-46. 3． 小鼠-小鼠B淋巴細胞雜交瘤 見巴德年主編 《當代免疫學技術與應用》pp.352-364. 北京醫科大學和協和醫科大學聯合出版社 1998 -- The darkest hour is that before the dawn. --

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