http://bdl.nease.net/Magzine/OtherPapers/cell%20fuse%20with%20B%20cell%20&%20hybridize%20tumour.htm 基本原理 分泌抗体的激活B细胞与骨髓瘤细胞融合，才能生成具有亲体细胞两方面特性即既可产生 抗体又可在体外无限繁殖的杂交瘤细胞，因此，细胞融合是单克隆抗体制备的中心环节。 细胞融合的方法多采用化学助融法，最常用的化学助融剂为聚乙二醇（Polyethylene glycol、PEG），分子量100-4000的PEG助融效果最好，对细胞的毒性相对小。此外，还可 利用电融合等物理方法，在亲本细胞的情况西很有适宜采用。本节介绍化学融合方法。抗 体分泌细胞是由免疫动物（小鼠或大鼠）的脾脏或淋巴结制备，与骨髓瘤细胞混合，并用 PEG使之融合。5-15天後，仅杂交瘤开始在选择培养基（见前）中生长。其後测定杂交瘤 分泌的特异抗体，一旦选出合用的阳性细胞，则进行克隆，亚克隆及冻存。 试剂及仪器 一般设备见前； l 培养基A：RPMI1640 + 2mmol/L 谷氨酰胺+ 1mmol/L丙酮酸钠+ 1 mmol/L非必 需氨基酸+青霉素100U/ml、链霉素100 μg/ml（有的实验室也加入10%NCTC109 培养基） l 培养基B：培养基A +3% FCS （见後说明） l 培养基C：培养基A + 1× HAT + 20% FCS（500ml） l 50 × HAT液或粉剂（有商品） l PEG1500 （有商品，可即用） l 1mol/L硫酸铜液 l 17mol/L NH4Cl 水溶液（消毒，用於红细胞溶解） l 培养皿（直径100或60mm） l 细胞粗滤器（筛孔：40 μm ） 操作步骤 一． 脾细胞及骨髓瘤细胞制备 由小鼠分离的脾细胞作为抗体生成细胞的方法已有多种介绍。在许多实验室应用的 操作方案仅稍有不同。淋巴结也可用为B细胞的来源。骨髓瘤细胞必须培养至少一周，要 求在融合日要达到对数生长期。所有的实验操作均需在消毒条件下进行。 （一）脾细胞制备 1．分离取出脾脏，置於含7ml培养基B的培养皿中（在动物房进行），将培养皿移入垂直 气流的通风橱中； 2．将脾脏移入另一含7ml培养基A的培养皿中，用镊子撕开脾脏，使大多数脾细胞释出； 3．用吸管吹打细胞团块，将混合液移入50ml聚丙乙烯管中，4℃沉降5min； 4．将细胞悬液移入另一50ml聚丙乙烯管， 200 × g 离心7min，弃上清； 5．用冰冷的0.17mol/L NH4Cl 水溶液（2-3ml/ 每个脾脏）悬起沉淀，在室温下培养 5-10 min，以溶解红细胞，然後缓慢加入45ml培养基A； 6．200 × g 离心7min，弃上清； 7．沉淀再悬入10ml 培养基A中。 （二）骨髓瘤细胞的制备 1．在对数生长期收获107-108的骨髓瘤细胞； 2．200 × g 离心7min，弃上清； 3．轻轻震动试管以松动沉淀，将细胞悬於20ml 培养基A中； 4．200 × g 离心7min，弃上清； 5．细胞悬於10 ml 培养基A中，取适量进行细胞计数； 6．200 × g 离心7min，弃上清； 7．沉淀再悬於10 ml 培养基A中。 二．细胞融合 1．以2：1混合脾细胞与骨髓瘤细胞； 2．加入培养基A到25ml； 3．在室温下，200 × g 离心7min，弃上清； 4．轻轻震动试管使松动沉淀，後置入37℃水浴； 5．用1000μl的加样器，缓慢（超过1min）逐滴加入700μl经37℃预温的PEG1500，并用 吸头搅拌； 6．经过1 min後，缓慢（超过3min）加入5ml培养基A； 7．再过1 min ，加入7ml 37℃预温的培养基A； 8．隔1 min，再加入7ml 37℃预温的培养基A（以达逐步稀释）； 9．室温下，200 × g 离心10min，弃上清； 10．再将沉淀小心地悬浮於培养基C，使细胞终浓度为1 × 106 脾细胞/ml； 11．在已加100 μl培养基C/孔的2-3块96孔板中，再加入100 μl/ 孔细胞悬液； 12．置入含5-8%CO2的37℃培养箱中； 13．一周後，每孔吸出100 μl上清，再加入100 μl培养基C，继续每周换液1-2次； 14．後续操作见以下实验後述。 实验要点及说明 1．可用DMEM (4.5 g/l葡萄糖) 代替RPMI (2 g/l葡萄糖)； 2．B细胞与骨髓瘤细胞之比也可为1：1或1：1.5； 3．细胞融合操作是关键步骤，要避免以吸管用力吸打； 4．在细胞融合後2-3天，要注意检测是否污染；霉菌在培养箱中污染速度迅速。一旦发现 污染，尽快弃出污染的培养皿； 5．在细胞融合後4-5天後，在显微镜观察可见到克隆。某些克隆可能在融合後7-8天才可 见到； 6．在确定已得到对抗原有明显的滴度的抗体及筛选条件已最佳化前，不要开始细胞融合 实验。 参考文献 1． Fazekas,de St Groth. And Scheidegger、D. (1980) Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Meth. 35,1-21. 2． Galfre、G. And Milstein、C. (1981) Preparation of monoclonal antibodies: strategy and procedures. Meth. Enzymol. 73、part B、3-46. 3． 小鼠-小鼠B淋巴细胞杂交瘤 见巴德年主编 《当代免疫学技术与应用》pp.352-364. 北京医科大学和协和医科大学联合出版社 1998 -- The darkest hour is that before the dawn. --

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