黃阿敏 | 成功大學醫學系生理學科暨生理學研究所 林學賦 | 成功大學醫學系生理學科暨生理學研究所 海馬迴的腦區之一齒狀回，是研究情境記憶烙痕的理想腦區。當我們處在不同的情境時， 會活化不同的齒狀回神經細胞。 「一朝被蛇咬，十年怕草繩」，這是大家熟悉的恐懼記憶。然而，記憶如何形成？記憶的 烙痕又是什麼？這是一百多年來神經科學家一直在尋找的答案。有人認為記憶的烙痕存在 於神經細胞之間，也就是說，記憶的烙痕存在於一群特定的神經細胞中。 記憶若是刻痕於一群特定的神經細胞，其充分且必要的條件是什麼？過去曾有人把特定的 神經細胞去除時，發現可以抹除恐懼記憶。也就是說，沒有了恐懼學習的神經細胞，就沒 有了恐懼記憶。這樣的證據提供了恐懼記憶的必要條件，但是充分條件的證據仍然不足。 意思是，若一群特定的神經細胞是恐懼記憶的烙痕，那麼必須有一個模擬的實驗，當活化 那群恐懼學習時的烙痕細胞，就能出現恐懼記憶。 然而，在多達幾千億的大腦神經細胞中，如何找到特定事件學習時所活化的那群稀少的神 經細胞，並且把它喚醒呢？發表在2012年3月《自然》期刊的一篇文章，應用光遺傳學法 （optogenetics）標定小鼠在恐懼學習時相對應的神經細胞，稍後再用特定波長的光線來 活化這些神經細胞，小鼠就表現了害怕、不敢動的記憶行為。這種方法不僅為大腦的研究 提供了新的利器，也回答了神經科學界長久以來的問題。 光遺傳學法是2010年全世界科學家票選出來的年度風雲研究法，這方法結合了基因工程學 和光學，可用來觀察和控制一組被基因標定的細胞。基因工程學的部分用來標定細胞，光 學的部分則用來活化被標定的細胞。 用來標定細胞的基因有好幾種，其中之一是視紫質通道基因。當神經細胞被這基因標定時 ，其細胞膜上會表現視紫質通道蛋白。光學的部分是以特定波長活化視紫質通道蛋白，當 這蛋白活化時，通道打開，造成神經細胞的去極化，而讓神經細胞活化。科學家就以光遺 傳學法來標定恐懼學習的相關細胞，並且利用光纖使它活化，然後觀察恐懼記憶的行為。 利用光遺傳學法來標定和恐懼學習相關的神經細胞，要從哪個腦區著手呢？科學家首先想 到的是腦中和記憶息息相關的海馬迴。海馬迴位在腦的邊緣葉，又可細分為好幾個小區， 其中之一稱為齒狀回。許多研究顯示齒狀回跟我們的方位感有關，當我們進入一個房間時 ，有小部分（2～4％）的神經細胞會活化，進入另一個房間時，又有另一小部分的神經細 胞會活化。而且這些細胞很忠實，當回到同一個房間時，又是相同的神經細胞會活化。因 此齒狀回是一個研究情境記憶烙痕很理想的腦區。 如何找到齒狀回中記憶烙痕正在形成的那群細胞呢？首先科學家先讓轉殖基因小鼠全身（ 包括齒狀回）都帶有一個特別基因，這個基因有兩部分，前面是c-fos啟動子，後面是四 環黴素調控蛋白（tetracyclin transactivator, 簡稱tTA）的基因。當小鼠學習時，神 經細胞活性增加，c-fos啟動子於是啟動tTA基因，而做出tTA蛋白。 另外，利用立體定位儀把特殊重組病毒注射到腦中的齒狀回。這種特殊病毒被設計成帶有 視紫質通道蛋白，且這蛋白的表現受到tTA蛋白的調控。當小鼠學習時，c-fos啟動子讓 tTA調控蛋白表達出來後，進一步讓視紫質通道蛋白做出來。也就是說，學習時才活化的 神經細胞會與眾不同，其細胞膜上由於能表現出紫質通道蛋白而被標定。 如何再度喚醒這群在學習時被視紫質通道蛋白標定的神經細胞呢？做法就是在小鼠的齒狀 回埋入光纖，光纖所給予的特定光波可以活化視紫質通道蛋白。視紫質通道蛋白活化後， 通道打開，造成神經細胞去極化，而讓神經細胞活化。因此測試記憶時，光纖啟動，神經 細胞可再度活化；光纖關閉，神經細胞就不被活化。如此藉由光纖的開關，可在瞬間控制 神經細胞的活性，然後觀察小鼠的記憶行為。 要在學習的恰當時機標定特定的神經細胞，還要再多加一個條件，就是在小鼠的食物中給 予四環黴素。四環黴素會干擾tTA，使它無法發揮功能。小鼠吃了含有四環黴素的食物， 齒狀回神經細胞膜上的視紫質通道蛋白不會表達出來，細胞就不會被標定。相反地，食物 中不再給予四環黴素時，tTA就會讓神經細胞膜上的視紫質通道蛋白表達出來，細胞就被 標定起來。因此，只要在食物中加入四環黴素與否，就可以控制是否只在學習進行時才把 對應的神經細胞標定起來。 要用什麼行為模式來做學習和記憶的測試呢？近二十年來，神經科學界最常用的行為模式 稱為恐懼制約學習。這種行為模式的其中一種做法，稱為情境式恐懼制約學習。這個方法 在第一天把小鼠放在一個行為箱A中，給予電擊的恐懼制約，第二天讓小鼠回到行為箱A， 小鼠就呈現害怕不敢動的恐懼記憶行為。可是如果放在完全不同的行為箱B中，小鼠不會 呈現恐懼記憶行為。許多實驗證實海馬迴在情境式恐懼制約學習中扮演舉足輕重的角色， 採用這行為模式再適合不過了。 然而，要利用光遺傳學法和情境式恐懼制約來提供恐懼記憶的充分條件，科學家們在方法 上必須做些修飾。做法是先讓小鼠在行為箱A中待5天，給予四環黴素食物，但是不給恐懼 制約。在這種情形下，視紫質通道蛋白不會表達，小鼠也不會呈現害怕行為。 接下來的兩天，食物中不給四環黴素，讓神經細胞上的視紫質通道蛋白有機會表現。再接 下來的一天，才在另一個行為箱B中給予恐懼制約，讓小鼠在這行為箱中學到聲音和電擊 連結而感到恐懼。這樣的小鼠不僅學到對電擊的恐懼，特別的是，負責恐懼學習的神經細 胞被視紫質通道蛋白標定了。也就是說，恐懼學習的烙痕細胞被標定了。 接下來就是關鍵結果的呈現，連續5天把小鼠放回行為箱A，觀察小鼠的恐懼記憶行為。剛 開始小鼠跟先前在行為箱A中的情形一樣，並不會感到害怕。若透過光纖給予特定波長的 光線，令人興奮的結果出現了—小鼠出現害怕不敢動的行為。然而，若光線不在時，害怕 的行為便不再出現。光線再啟動，害怕行為又出現。也就是說，用光線活化恐懼學習的烙 痕細胞，恐懼記憶的行為就出現了。 真的是因為活化恐懼學習時對應的神經細胞，就引發恐懼的記憶行為嗎？科學家做了很多 的小心求證。首先，還記得在小鼠齒狀回埋入的光纖嗎？如果透過光纖激活的不是恐懼學 習的烙痕細胞，那麼也不會有恐懼記憶的行為出現。例如，在一模一樣的情境下，如果不 給電擊，即使有神經細胞被基因標定，但和恐懼學習無關，那麼光纖即使激活這些細胞， 也不會有恐懼記憶。 再者，如果在另外一個情境學習，即使神經細胞被標定，這些細胞雖然也能被光纖激活， 但不會造成恐懼記憶。也就是說，特定的情境學習活化特定一群的神經細胞，不會混淆。 這研究利用光遺傳學法首度提出了恐懼學習的充分條件—直接活化一群參與記憶形成的細 胞，就能誘發記憶行為。這個研究呼應了過去的結果，告訴我們一群特定的神經細胞是記 憶烙痕的細胞基礎，而且特定的學習有特定的細胞來因應。 然而學習有不同的面向，整個學習過程中有不同的線索都足以誘發記憶，完整的記憶可能 由幾個不同的記憶烙痕共同表徵。光遺傳學法提供了一個利器，在未來或許可以幫助科學 家逐一定出記憶烙痕的各部分，以及它們之間的相互關係，而讓我們對於整個記憶烙痕有 更全盤的了解。 深度閱讀 Liu, X., S. Ramirez, P.T. Pang, C.B. Puryear, A. Govindarajan, K. Deisseroth, S. Tonegawa (2012) Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature, 484 (7394), 381-385. 來源：《科學發展》2013年2月，482期，38 ~ 43頁 -- http://www.nsc.gov.tw/scitechvista/zh-tw/Articles/C/0/1/10/1/1824.htm 其實我對於Optogenetic stimulation都覺得很神奇 --

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