黄阿敏 | 成功大学医学系生理学科暨生理学研究所 林学赋 | 成功大学医学系生理学科暨生理学研究所 海马回的脑区之一齿状回，是研究情境记忆烙痕的理想脑区。当我们处在不同的情境时， 会活化不同的齿状回神经细胞。 「一朝被蛇咬，十年怕草绳」，这是大家熟悉的恐惧记忆。然而，记忆如何形成？记忆的 烙痕又是什麽？这是一百多年来神经科学家一直在寻找的答案。有人认为记忆的烙痕存在 於神经细胞之间，也就是说，记忆的烙痕存在於一群特定的神经细胞中。 记忆若是刻痕於一群特定的神经细胞，其充分且必要的条件是什麽？过去曾有人把特定的 神经细胞去除时，发现可以抹除恐惧记忆。也就是说，没有了恐惧学习的神经细胞，就没 有了恐惧记忆。这样的证据提供了恐惧记忆的必要条件，但是充分条件的证据仍然不足。 意思是，若一群特定的神经细胞是恐惧记忆的烙痕，那麽必须有一个模拟的实验，当活化 那群恐惧学习时的烙痕细胞，就能出现恐惧记忆。 然而，在多达几千亿的大脑神经细胞中，如何找到特定事件学习时所活化的那群稀少的神 经细胞，并且把它唤醒呢？发表在2012年3月《自然》期刊的一篇文章，应用光遗传学法 （optogenetics）标定小鼠在恐惧学习时相对应的神经细胞，稍後再用特定波长的光线来 活化这些神经细胞，小鼠就表现了害怕、不敢动的记忆行为。这种方法不仅为大脑的研究 提供了新的利器，也回答了神经科学界长久以来的问题。 光遗传学法是2010年全世界科学家票选出来的年度风云研究法，这方法结合了基因工程学 和光学，可用来观察和控制一组被基因标定的细胞。基因工程学的部分用来标定细胞，光 学的部分则用来活化被标定的细胞。 用来标定细胞的基因有好几种，其中之一是视紫质通道基因。当神经细胞被这基因标定时 ，其细胞膜上会表现视紫质通道蛋白。光学的部分是以特定波长活化视紫质通道蛋白，当 这蛋白活化时，通道打开，造成神经细胞的去极化，而让神经细胞活化。科学家就以光遗 传学法来标定恐惧学习的相关细胞，并且利用光纤使它活化，然後观察恐惧记忆的行为。 利用光遗传学法来标定和恐惧学习相关的神经细胞，要从哪个脑区着手呢？科学家首先想 到的是脑中和记忆息息相关的海马回。海马回位在脑的边缘叶，又可细分为好几个小区， 其中之一称为齿状回。许多研究显示齿状回跟我们的方位感有关，当我们进入一个房间时 ，有小部分（2～4％）的神经细胞会活化，进入另一个房间时，又有另一小部分的神经细 胞会活化。而且这些细胞很忠实，当回到同一个房间时，又是相同的神经细胞会活化。因 此齿状回是一个研究情境记忆烙痕很理想的脑区。 如何找到齿状回中记忆烙痕正在形成的那群细胞呢？首先科学家先让转殖基因小鼠全身（ 包括齿状回）都带有一个特别基因，这个基因有两部分，前面是c-fos启动子，後面是四 环霉素调控蛋白（tetracyclin transactivator, 简称tTA）的基因。当小鼠学习时，神 经细胞活性增加，c-fos启动子於是启动tTA基因，而做出tTA蛋白。 另外，利用立体定位仪把特殊重组病毒注射到脑中的齿状回。这种特殊病毒被设计成带有 视紫质通道蛋白，且这蛋白的表现受到tTA蛋白的调控。当小鼠学习时，c-fos启动子让 tTA调控蛋白表达出来後，进一步让视紫质通道蛋白做出来。也就是说，学习时才活化的 神经细胞会与众不同，其细胞膜上由於能表现出紫质通道蛋白而被标定。 如何再度唤醒这群在学习时被视紫质通道蛋白标定的神经细胞呢？做法就是在小鼠的齿状 回埋入光纤，光纤所给予的特定光波可以活化视紫质通道蛋白。视紫质通道蛋白活化後， 通道打开，造成神经细胞去极化，而让神经细胞活化。因此测试记忆时，光纤启动，神经 细胞可再度活化；光纤关闭，神经细胞就不被活化。如此藉由光纤的开关，可在瞬间控制 神经细胞的活性，然後观察小鼠的记忆行为。 要在学习的恰当时机标定特定的神经细胞，还要再多加一个条件，就是在小鼠的食物中给 予四环霉素。四环霉素会干扰tTA，使它无法发挥功能。小鼠吃了含有四环霉素的食物， 齿状回神经细胞膜上的视紫质通道蛋白不会表达出来，细胞就不会被标定。相反地，食物 中不再给予四环霉素时，tTA就会让神经细胞膜上的视紫质通道蛋白表达出来，细胞就被 标定起来。因此，只要在食物中加入四环霉素与否，就可以控制是否只在学习进行时才把 对应的神经细胞标定起来。 要用什麽行为模式来做学习和记忆的测试呢？近二十年来，神经科学界最常用的行为模式 称为恐惧制约学习。这种行为模式的其中一种做法，称为情境式恐惧制约学习。这个方法 在第一天把小鼠放在一个行为箱A中，给予电击的恐惧制约，第二天让小鼠回到行为箱A， 小鼠就呈现害怕不敢动的恐惧记忆行为。可是如果放在完全不同的行为箱B中，小鼠不会 呈现恐惧记忆行为。许多实验证实海马回在情境式恐惧制约学习中扮演举足轻重的角色， 采用这行为模式再适合不过了。 然而，要利用光遗传学法和情境式恐惧制约来提供恐惧记忆的充分条件，科学家们在方法 上必须做些修饰。做法是先让小鼠在行为箱A中待5天，给予四环霉素食物，但是不给恐惧 制约。在这种情形下，视紫质通道蛋白不会表达，小鼠也不会呈现害怕行为。 接下来的两天，食物中不给四环霉素，让神经细胞上的视紫质通道蛋白有机会表现。再接 下来的一天，才在另一个行为箱B中给予恐惧制约，让小鼠在这行为箱中学到声音和电击 连结而感到恐惧。这样的小鼠不仅学到对电击的恐惧，特别的是，负责恐惧学习的神经细 胞被视紫质通道蛋白标定了。也就是说，恐惧学习的烙痕细胞被标定了。 接下来就是关键结果的呈现，连续5天把小鼠放回行为箱A，观察小鼠的恐惧记忆行为。刚 开始小鼠跟先前在行为箱A中的情形一样，并不会感到害怕。若透过光纤给予特定波长的 光线，令人兴奋的结果出现了—小鼠出现害怕不敢动的行为。然而，若光线不在时，害怕 的行为便不再出现。光线再启动，害怕行为又出现。也就是说，用光线活化恐惧学习的烙 痕细胞，恐惧记忆的行为就出现了。 真的是因为活化恐惧学习时对应的神经细胞，就引发恐惧的记忆行为吗？科学家做了很多 的小心求证。首先，还记得在小鼠齿状回埋入的光纤吗？如果透过光纤激活的不是恐惧学 习的烙痕细胞，那麽也不会有恐惧记忆的行为出现。例如，在一模一样的情境下，如果不 给电击，即使有神经细胞被基因标定，但和恐惧学习无关，那麽光纤即使激活这些细胞， 也不会有恐惧记忆。 再者，如果在另外一个情境学习，即使神经细胞被标定，这些细胞虽然也能被光纤激活， 但不会造成恐惧记忆。也就是说，特定的情境学习活化特定一群的神经细胞，不会混淆。 这研究利用光遗传学法首度提出了恐惧学习的充分条件—直接活化一群参与记忆形成的细 胞，就能诱发记忆行为。这个研究呼应了过去的结果，告诉我们一群特定的神经细胞是记 忆烙痕的细胞基础，而且特定的学习有特定的细胞来因应。 然而学习有不同的面向，整个学习过程中有不同的线索都足以诱发记忆，完整的记忆可能 由几个不同的记忆烙痕共同表徵。光遗传学法提供了一个利器，在未来或许可以帮助科学 家逐一定出记忆烙痕的各部分，以及它们之间的相互关系，而让我们对於整个记忆烙痕有 更全盘的了解。 深度阅读 Liu, X., S. Ramirez, P.T. Pang, C.B. Puryear, A. Govindarajan, K. Deisseroth, S. Tonegawa (2012) Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature, 484 (7394), 381-385. 来源：《科学发展》2013年2月，482期，38 ~ 43页 -- http://www.nsc.gov.tw/scitechvista/zh-tw/Articles/C/0/1/10/1/1824.htm 其实我对於Optogenetic stimulation都觉得很神奇 --

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