作者soursourhsua (ㄏㄏ)
看板Chemistry
標題[實驗] HPLC壓力升高的問題
時間Fri Jun 7 00:47:08 2019
我最近在用HPLC，因為是新手沒有經驗，碰到Column 壓力降不下來的問題...
【以下為使用經過】
我用的Column是 250*4.6 mm，column 是保存在100ACN ，壓力33，洗機都是用70水30ACN，壓力113。
上機的時候mobile phase 是用磷酸鹽水溶液（有加一點甲酸）和ACN ，比例為70：30跑梯度。用螢光偵測器。
某一次打完之後壓力就高起來，100ACN 從33變到60（甚至更高），70水30ACN從113變到160。上機的(70ACN30磷酸鹽 )平衡壓力從65升高到108。
找到了幾個問題並排除：
1. 換掉旋轉墊片
2. 二次水是髒的（放很久都沒換，之前不知道水要常換...）
3. Precolumn filter 有超音波震盪過
Column 拆下來，前面那端（含precolumn ）壓力在10以下，所以認為應該是column 塞住，試過的清洗方式：100水，100ACN ，100甲醇，70/80/90水30/20/10ACN或甲醇，100ACN流速1.8（其他方式流速都是1），也有試過逆洗。100ACN 高到99的情況下，清洗之後降到55，但如果加水進去，70水30ACN，壓力還是高。
【問題】
1. 應該怎麼清洗Column 比較適當？
我這支是amino 的，HILIC 屬於Normal phase ，我看廠商建議Normal phase 用isopropanol ，Hexane ，Ethanol 清洗，但因為沒有用過所以還不敢試。之前老師跟學長都叫我用ACN 和水，或是ACN 換成甲醇，但甲醇洗壓力很高，會將近或高於200。
2.目前壓力升高的狀況會影響分析結果嗎？
3.之前看板上有討論到有機溶劑會讓磷酸鹽析出的問題，想請問跑梯度的話每分鐘變化量要到多少才比較不容易析出？
還有磷酸鹽水溶液（含0.1%甲酸）要多久替換比較好？
麻煩高手相救了Q
感謝！！！
-----
Sent from JPTT on my OPPO CPH1719.
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.9.8.159 (臺灣)
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Chemistry/M.1559839630.A.128.html
1F：推 sqqc89: 我不知道我們的機型一不一樣 如果我公司的HPLC壓力太高 可 06/07 02:03
2F：→ sqqc89: 能是因為紅寶石塞住了 把它換掉壓力就會降下來了 06/07 02:03
3F：推 jason4101: call廠商來排除狀況？ 06/07 08:08
4F：→ soursourhsua: 紅寶石的部分我之後確認看看，所以不是Column 的問 06/07 10:17
5F：→ soursourhsua: 題嗎？ 06/07 10:17
6F：→ soursourhsua: 之前有請廠商來看過，那時候發現墊片堵住所以換了墊 06/07 10:17
7F：→ soursourhsua: 片。也有跟業務討論過column 清洗的問題 06/07 10:17
8F：推 chengeric: 可能column前端frit堵了,浸泡在isopropanol超聲看看 06/07 11:22
9F：推 tony15899: 1. 管柱髒(注射樣品沒洗出來)跟壓力沒太大關連 06/07 15:02
10F：→ tony15899: 2. 有裝保護管柱就不太可能在column frit堵住 06/07 15:03
11F：→ tony15899: 3. 最有可能是鹽類沉積 用高比例水相去洗(可加溫) 06/07 15:07
12F：→ tony15899: 水相理論上是要每次換 真的很懶的話不要隔周 06/07 15:09
13F：→ tony15899: 但這取決於實驗室環境 有些人會在水相加5%有機相 06/07 15:09
14F：→ tony15899: precolumn如果是指保護管柱的話 超音波沒什麼用 06/07 15:11
15F：→ tony15899: 萬一塞住就是直接換一顆或是更換內部過濾材 06/07 15:11
16F：推 Ianthegood: 同意tony大 水相洗跟換precolumn 06/07 16:12
17F：→ Ianthegood: 磷酸還有70%水應該是不會掉出來吧... 06/07 16:14
18F：→ i19890813: 就一段一段測試看看是哪一段壓力變大 06/07 21:58
19F：→ i19890813: pump出來應該要幾乎是0 再接precolumn 再接column 06/07 21:59
20F：→ i19890813: 看哪一段壓力有異常較高 這樣去抓就知道是哪裡出問題 06/07 22:00
21F：推 encoreg10917: 洗column 不會用 100% 水，至少會混 10% ACN 06/10 15:54
22F：→ encoreg10917: 藥廠的去離子水保存期限規定1 週 06/10 15:55
23F：推 Ianthegood: 樓上但是他是NP不是RP耶 一樣不用全水嗎? 06/10 23:21
24F：推 encoreg10917: 通常 Normal phase 不會用水洗啊...,NP 只會拿用在 06/11 02:00
25F：→ encoreg10917: Hexane/heptane/IPA/DCM/EtOH 這些溶劑，碰水會死 06/11 02:00
26F：→ encoreg10917: 很快，RP 則是C8 C18 這類的比較多，可以碰水。 06/11 02:00
27F：推 encoreg10917: 主要理由跟材質極性有關(廢話) 06/11 02:08
28F：→ soursourhsua: 但這支是HILIC ，相較於NP，移動相可以用高極性的溶 06/11 09:41
29F：→ soursourhsua: 劑，所以100%的水不要洗太久應該還好（？ 06/11 09:42
30F：推 encoreg10917: column 買來說明書會寫保存條件，我不知道你的 co 06/12 10:36
31F：→ encoreg10917: lumn 是什麼材質，常見情況是 RP 會存在 65~100% 06/12 10:36
32F：→ encoreg10917: 的 ACN/H2O 或 MeOH/H20 中, NP 通常都保存在 He 06/12 10:36
33F：→ encoreg10917: x/IPA = 90/10 中。 06/12 10:36
34F：推 encoreg10917: olumn 卡住了該救的方法都用了還是沒起色，就放棄 06/12 10:38
35F：→ encoreg10917: ，雖然我知道 column 對學校研究室是很大的開銷 06/12 10:38
36F：→ encoreg10917: 清洗 column 超級不建議純水 100% 去洗，可以 H20 06/12 10:42
37F：→ encoreg10917: /ACN = 90/10 低流速 (0.3~0.5 ml/min) 洗個 60~9 06/12 10:42
38F：→ encoreg10917: 0 分鐘，再慢慢置換比例到保存條件。 06/12 10:42
39F：推 encoreg10917: 壓力高，如果機檯可以承受，還是可以試打看看(打已 06/12 10:52
40F：→ encoreg10917: 知或打標準品)，確認RT， Resolution 及 Tailing 06/12 10:52
41F：→ encoreg10917: 這類的有沒有差異，沒差太多還是能用，使用時一開 06/12 10:52
42F：→ encoreg10917: 始先低流速慢慢升上去，可以避免一開始過壓當機。 06/12 10:52