作者soursourhsua (ㄏㄏ)
看板Chemistry
标题[实验] HPLC压力升高的问题
时间Fri Jun 7 00:47:08 2019
我最近在用HPLC，因为是新手没有经验，碰到Column 压力降不下来的问题...
【以下为使用经过】
我用的Column是 250*4.6 mm，column 是保存在100ACN ，压力33，洗机都是用70水30ACN，压力113。
上机的时候mobile phase 是用磷酸盐水溶液（有加一点甲酸）和ACN ，比例为70：30跑梯度。用萤光侦测器。
某一次打完之後压力就高起来，100ACN 从33变到60（甚至更高），70水30ACN从113变到160。上机的(70ACN30磷酸盐 )平衡压力从65升高到108。
找到了几个问题并排除：
1. 换掉旋转垫片
2. 二次水是脏的（放很久都没换，之前不知道水要常换...）
3. Precolumn filter 有超音波震荡过
Column 拆下来，前面那端（含precolumn ）压力在10以下，所以认为应该是column 塞住，试过的清洗方式：100水，100ACN ，100甲醇，70/80/90水30/20/10ACN或甲醇，100ACN流速1.8（其他方式流速都是1），也有试过逆洗。100ACN 高到99的情况下，清洗之後降到55，但如果加水进去，70水30ACN，压力还是高。
【问题】
1. 应该怎麽清洗Column 比较适当？
我这支是amino 的，HILIC 属於Normal phase ，我看厂商建议Normal phase 用isopropanol ，Hexane ，Ethanol 清洗，但因为没有用过所以还不敢试。之前老师跟学长都叫我用ACN 和水，或是ACN 换成甲醇，但甲醇洗压力很高，会将近或高於200。
2.目前压力升高的状况会影响分析结果吗？
3.之前看板上有讨论到有机溶剂会让磷酸盐析出的问题，想请问跑梯度的话每分钟变化量要到多少才比较不容易析出？
还有磷酸盐水溶液（含0.1%甲酸）要多久替换比较好？
麻烦高手相救了Q
感谢！！！
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1F：推 sqqc89: 我不知道我们的机型一不一样 如果我公司的HPLC压力太高 可 06/07 02:03
2F：→ sqqc89: 能是因为红宝石塞住了 把它换掉压力就会降下来了 06/07 02:03
3F：推 jason4101: call厂商来排除状况？ 06/07 08:08
4F：→ soursourhsua: 红宝石的部分我之後确认看看，所以不是Column 的问 06/07 10:17
5F：→ soursourhsua: 题吗？ 06/07 10:17
6F：→ soursourhsua: 之前有请厂商来看过，那时候发现垫片堵住所以换了垫 06/07 10:17
7F：→ soursourhsua: 片。也有跟业务讨论过column 清洗的问题 06/07 10:17
8F：推 chengeric: 可能column前端frit堵了,浸泡在isopropanol超声看看 06/07 11:22
9F：推 tony15899: 1. 管柱脏(注射样品没洗出来)跟压力没太大关连 06/07 15:02
10F：→ tony15899: 2. 有装保护管柱就不太可能在column frit堵住 06/07 15:03
11F：→ tony15899: 3. 最有可能是盐类沉积 用高比例水相去洗(可加温) 06/07 15:07
12F：→ tony15899: 水相理论上是要每次换 真的很懒的话不要隔周 06/07 15:09
13F：→ tony15899: 但这取决於实验室环境 有些人会在水相加5%有机相 06/07 15:09
14F：→ tony15899: precolumn如果是指保护管柱的话 超音波没什麽用 06/07 15:11
15F：→ tony15899: 万一塞住就是直接换一颗或是更换内部过滤材 06/07 15:11
16F：推 Ianthegood: 同意tony大 水相洗跟换precolumn 06/07 16:12
17F：→ Ianthegood: 磷酸还有70%水应该是不会掉出来吧... 06/07 16:14
18F：→ i19890813: 就一段一段测试看看是哪一段压力变大 06/07 21:58
19F：→ i19890813: pump出来应该要几乎是0 再接precolumn 再接column 06/07 21:59
20F：→ i19890813: 看哪一段压力有异常较高 这样去抓就知道是哪里出问题 06/07 22:00
21F：推 encoreg10917: 洗column 不会用 100% 水，至少会混 10% ACN 06/10 15:54
22F：→ encoreg10917: 药厂的去离子水保存期限规定1 周 06/10 15:55
23F：推 Ianthegood: 楼上但是他是NP不是RP耶 一样不用全水吗? 06/10 23:21
24F：推 encoreg10917: 通常 Normal phase 不会用水洗啊...,NP 只会拿用在 06/11 02:00
25F：→ encoreg10917: Hexane/heptane/IPA/DCM/EtOH 这些溶剂，碰水会死 06/11 02:00
26F：→ encoreg10917: 很快，RP 则是C8 C18 这类的比较多，可以碰水。 06/11 02:00
27F：推 encoreg10917: 主要理由跟材质极性有关(废话) 06/11 02:08
28F：→ soursourhsua: 但这支是HILIC ，相较於NP，移动相可以用高极性的溶 06/11 09:41
29F：→ soursourhsua: 剂，所以100%的水不要洗太久应该还好（？ 06/11 09:42
30F：推 encoreg10917: column 买来说明书会写保存条件，我不知道你的 co 06/12 10:36
31F：→ encoreg10917: lumn 是什麽材质，常见情况是 RP 会存在 65~100% 06/12 10:36
32F：→ encoreg10917: 的 ACN/H2O 或 MeOH/H20 中, NP 通常都保存在 He 06/12 10:36
33F：→ encoreg10917: x/IPA = 90/10 中。 06/12 10:36
34F：推 encoreg10917: olumn 卡住了该救的方法都用了还是没起色，就放弃 06/12 10:38
35F：→ encoreg10917: ，虽然我知道 column 对学校研究室是很大的开销 06/12 10:38
36F：→ encoreg10917: 清洗 column 超级不建议纯水 100% 去洗，可以 H20 06/12 10:42
37F：→ encoreg10917: /ACN = 90/10 低流速 (0.3~0.5 ml/min) 洗个 60~9 06/12 10:42
38F：→ encoreg10917: 0 分钟，再慢慢置换比例到保存条件。 06/12 10:42
39F：推 encoreg10917: 压力高，如果机台可以承受，还是可以试打看看(打已 06/12 10:52
40F：→ encoreg10917: 知或打标准品)，确认RT， Resolution 及 Tailing 06/12 10:52
41F：→ encoreg10917: 这类的有没有差异，没差太多还是能用，使用时一开 06/12 10:52
42F：→ encoreg10917: 始先低流速慢慢升上去，可以避免一开始过压当机。 06/12 10:52