作者xxqoo123 (一季皆好日)
看板Chemistry
標題[實驗]請教各位HPLC的一些問題
時間Sat Aug 27 11:58:46 2016
小弟某私立大學生科系進職場,只在大學分析化學學過HPLC理論
從沒碰過HPLC,最近老闆買了一台HITACHI的HPLC,裡面是C18的reverse phase
主管叫我去學了三周我仍然一頭霧水,麻煩請各位前輩賜教
Q1:得到的peak面積轉成濃度是負值
我們做vitamin B2的分離,方法是廠商提供的如下
mobile phase:己脘磺酸鈉+冰醋酸水溶液+MeOH
solvent:1%的醋酸水溶液
一起跑standard和sample
最後以standard的配置濃度ppm,對peak面積作圖得到檢量線R平方>0.995
得到公式y=ax+b,套入sample面積,濃度竟然是負值= =
廠商說是因為我們的standard濃度配置太高,調低即可得出正確值
小弟才疏學淺的數學經驗,再多做幾筆standard應該也是會在同一條直線公式上吧?
小弟已經重複4~5次這個實驗都得到差不多的結果,是方法有問題嗎?
Q2:在板上有看到關於column的壓力值,多少才是正常值呢?
每次關機前我用純水下去清洗30分鐘,再換成純甲醇清洗30分鐘
最後在甲醇相壓力是60幾kgf/cm2
平時就浸潤在甲醇裡面,感覺壓力有點偏高?
不會弄沒幾天column就被我弄壞了吧=.=
我平時做實驗的mobile phase會用濾膜(孔徑0.45um)抽氣過濾
sample打進樣品瓶裡面也會用小飛碟(syringe filter)過濾
清洗液也都有用振盪器degas,炭頭放入時不同溶液都先purge 30s
只有第一次忘記過濾mobile phase...
Q3:關於分析方法可以請教各位前輩該去哪裡找資料呢?
畢竟google跟廠商的方法是不被接受的= =
我所知道的就AOAC
因為我們短期目標是只做vitamine的定性與定量
希望可以有中文的版本@@
Q4:基線有些時候會後期傾斜,ex前20分鐘平穩,後20分鐘才傾斜
廠商說是mobile phase的不足或是sample本身特性才會這樣
小弟配的mobile phase量絕對夠...
做了兩次sample基線都有點歪歪的,歪的程度不大相同而已
真的是sample會跑斜的嗎?匪夷所思...
小弟才疏學淺,大學打混摸魚,背景知識不足爬文常常看無
請各位不吝賜教,若是可以推薦資料讓我自行閱讀更是感激不盡
P.S化學實驗方法也拜託推薦一下,我每次配藥都覺得誤差有點大...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 114.26.179.243
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1F：→ EmberCelica: 你的sample濃度有在檢量線濃度範圍的20-80%之間嗎 08/27 12:45
2F：推 seven7wk: Q1:樣品濃度必須介於檢量線最低和最高之間 比如說樣品預 08/27 12:49
3F：→ seven7wk: 估濃度是1.25ppm 那檢量線可能就配0.01，0.05，1.0，1.5 08/27 12:49
4F：→ seven7wk: ，2.0ppm。你可以依照你先前打的推估一下樣品大約的濃 08/27 12:49
5F：→ seven7wk: 度吧。 08/27 12:49
有,樣品是測試市面上含有vit B2的液體產品,看他的罐標下去推算而得
ex100cc商品含20mg,我取了5CC應是1mg,定容至100ml得到10ppm
我standard最低做到0.1ppm
樣品取樣前有先用震盪器均勻取中段樣品
還是負值- -
※ 編輯: xxqoo123 (114.26.191.148), 08/27/2016 13:24:10
6F：→ EmberCelica: 你的線濃度做幾個點？ 最高到多少 08/27 15:18
我前幾次濃度做分別是1,10,25,50ppm
最後一次做20,10,1,0.1ppm
兩種濃度區間得到都是負值
7F：推 HPLC: 你做出來的面積 有落在檢量線之間? 如果有 會不會是你算錯? 08/27 18:48
8F：→ HPLC: 甲醇壓力 流速？ 管柱大小？ 膠體大小？ 如果是1 mL/min 250 08/27 18:52
9F：→ HPLC: x4.6 5 micro 我覺得正常 08/27 18:52
10F：→ HPLC: 方便給張圖看一下嗎? 很難想像你的斜 08/27 18:55
11F：→ HPLC: 你看有沒有公告方法吧 08/27 18:55
抱歉@@有些問題我禮拜一上班完才能回答你...
清洗時是甲醇1ml/min 壓力是60-65kgf/cm2左右飄移
跑vit B2流速是1.5ml/min
sample面積都是4XX-6XX
standard面積都是幾萬到幾十萬
12F：→ tony15899: 怎麼會看罐標呢 市售商品添加量根本不準是常識 08/27 19:28
我們有個營養師顧問說
營養品的添加量需大於等於罐標,政府才會核准上市
我們也有測過同一支市售產品的vit C是超過罐標的
※ 編輯: xxqoo123 (111.253.179.62), 08/27/2016 21:37:44
13F：→ EmberCelica: 不然試試看標準添加法看看？ 08/27 21:50
抱歉我不知道什麼是標準添加法...之前在食藥署的網頁只有維生素E的HPLC檢驗法
14F：推 HPLC: sample 跟 標準品差這麼多 當然可能會負值 08/27 22:12
15F：→ HPLC: 清洗的部分 如果column跟我說的一樣 那壓力差不多 08/27 22:14
16F：推 HPLC: 你的樣品沒落在你做的檢量線有下面的可能 1.樣品含量標示有 08/27 22:22
17F：→ HPLC: 問題 2.你標準品濃度配錯 08/27 22:22
請教HPLC大,若是sample有peak出現就代表我的分析是有意義的吧?
因為我主管在懷疑我是不是實驗過程誤差
才會導致得不到實驗的正確值(罐標)
我們天秤是微量天秤可得值到0.0001g,秤重100mg時我會誤差10mg左右
這樣的誤差會太大嗎..?
我再去做更低的standard濃度再來跟您確認
18F：→ kdjf: 你的detector是UV/Ri? 08/27 23:21
我確認過後再回覆KD大
19F：推 tony15899: 要確認就直接在樣品裡加標準品測添加回收率 08/27 23:28
Tony大有更完整的論述可以讓我參考嗎?小弟不太清楚回收率...
20F：→ o810418: 還有食藥署的公告檢驗方法若有可以參考 08/28 00:22
21F：→ o810418: 你面積是幾十萬可能是RI? sample的面積太低了 08/28 00:23
22F：→ o810418: 幾百在ri幾乎都算雜訊等級的程度 你sample是不是有配錯 08/28 00:24
23F：→ o810418: 我對uv跟ri的印象若都是一個40mg/5mL左右的東西 08/28 00:25
24F：→ o810418: 面積大概分別3萬與幾十萬的差異 當然廠牌不同應該也有差 08/28 00:25
25F：→ o810418: 但幾百對上你標準品幾萬，應該你SAMPLE問題很大orz 08/28 00:25
食藥署我之前翻過只有維生素E的方法...也請教過廠商
廠商說他的方法別人做得出來,我們也要做的出來才對
※ 編輯: xxqoo123 (111.253.172.233), 08/28/2016 09:28:42
※ 編輯: xxqoo123 (111.253.172.233), 08/28/2016 09:32:38
26F：→ HPLC: 你的意思是說 100 mg 你可以秤成110~90 mg? 這其實還滿誇張 08/28 15:18
27F：→ HPLC: 的 但只要濃度不要跑 其實無所謂 比如說你濃度要 100 mg/mL 08/28 15:18
28F：→ HPLC: 但你秤成90 mg 那你就加0.9 mL的溶劑溜 這樣濃度就是100 mg/ 08/28 15:18
29F：→ HPLC: mL (1 mg/mL =1000 ppm) 08/28 15:18
30F：→ HPLC: 當然 我是主管 我一定不會先覺的儀器有問題 一定是人的誤差 08/28 15:23
31F：→ HPLC: 佔很大的比例 08/28 15:23
32F：推 good159456: 建議先確認sample 的吸收波長在哪邊吧！ 08/28 20:47
33F：推 jeff79723: 請問檢量線的配法是怎們配的?中間怎們稀釋的?，感覺sta 08/29 11:07
34F：→ jeff79723: ndard 20ppp 面積在幾十萬有點高。是不是沒有稀釋好。 08/29 11:07
35F：→ jeff79723: 當然跟單位有關。 08/29 11:07