作者xxqoo123 (一季皆好日)
看板Chemistry
标题[实验]请教各位HPLC的一些问题
时间Sat Aug 27 11:58:46 2016
小弟某私立大学生科系进职场,只在大学分析化学学过HPLC理论
从没碰过HPLC,最近老板买了一台HITACHI的HPLC,里面是C18的reverse phase
主管叫我去学了三周我仍然一头雾水,麻烦请各位前辈赐教
Q1:得到的peak面积转成浓度是负值
我们做vitamin B2的分离,方法是厂商提供的如下
mobile phase:己脘磺酸钠+冰醋酸水溶液+MeOH
solvent:1%的醋酸水溶液
一起跑standard和sample
最後以standard的配置浓度ppm,对peak面积作图得到检量线R平方>0.995
得到公式y=ax+b,套入sample面积,浓度竟然是负值= =
厂商说是因为我们的standard浓度配置太高,调低即可得出正确值
小弟才疏学浅的数学经验,再多做几笔standard应该也是会在同一条直线公式上吧?
小弟已经重复4~5次这个实验都得到差不多的结果,是方法有问题吗?
Q2:在板上有看到关於column的压力值,多少才是正常值呢?
每次关机前我用纯水下去清洗30分钟,再换成纯甲醇清洗30分钟
最後在甲醇相压力是60几kgf/cm2
平时就浸润在甲醇里面,感觉压力有点偏高?
不会弄没几天column就被我弄坏了吧=.=
我平时做实验的mobile phase会用滤膜(孔径0.45um)抽气过滤
sample打进样品瓶里面也会用小飞碟(syringe filter)过滤
清洗液也都有用振荡器degas,炭头放入时不同溶液都先purge 30s
只有第一次忘记过滤mobile phase...
Q3:关於分析方法可以请教各位前辈该去哪里找资料呢?
毕竟google跟厂商的方法是不被接受的= =
我所知道的就AOAC
因为我们短期目标是只做vitamine的定性与定量
希望可以有中文的版本@@
Q4:基线有些时候会後期倾斜,ex前20分钟平稳,後20分钟才倾斜
厂商说是mobile phase的不足或是sample本身特性才会这样
小弟配的mobile phase量绝对够...
做了两次sample基线都有点歪歪的,歪的程度不大相同而已
真的是sample会跑斜的吗?匪夷所思...
小弟才疏学浅,大学打混摸鱼,背景知识不足爬文常常看无
请各位不吝赐教,若是可以推荐资料让我自行阅读更是感激不尽
P.S化学实验方法也拜托推荐一下,我每次配药都觉得误差有点大...
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1F：→ EmberCelica: 你的sample浓度有在检量线浓度范围的20-80%之间吗 08/27 12:45
2F：推 seven7wk: Q1:样品浓度必须介於检量线最低和最高之间 比如说样品预 08/27 12:49
3F：→ seven7wk: 估浓度是1.25ppm 那检量线可能就配0.01，0.05，1.0，1.5 08/27 12:49
4F：→ seven7wk: ，2.0ppm。你可以依照你先前打的推估一下样品大约的浓 08/27 12:49
5F：→ seven7wk: 度吧。 08/27 12:49
有,样品是测试市面上含有vit B2的液体产品,看他的罐标下去推算而得
ex100cc商品含20mg,我取了5CC应是1mg,定容至100ml得到10ppm
我standard最低做到0.1ppm
样品取样前有先用震荡器均匀取中段样品
还是负值- -
※ 编辑: xxqoo123 (114.26.191.148), 08/27/2016 13:24:10
6F：→ EmberCelica: 你的线浓度做几个点？ 最高到多少 08/27 15:18
我前几次浓度做分别是1,10,25,50ppm
最後一次做20,10,1,0.1ppm
两种浓度区间得到都是负值
7F：推 HPLC: 你做出来的面积 有落在检量线之间? 如果有 会不会是你算错? 08/27 18:48
8F：→ HPLC: 甲醇压力 流速？ 管柱大小？ 胶体大小？ 如果是1 mL/min 250 08/27 18:52
9F：→ HPLC: x4.6 5 micro 我觉得正常 08/27 18:52
10F：→ HPLC: 方便给张图看一下吗? 很难想像你的斜 08/27 18:55
11F：→ HPLC: 你看有没有公告方法吧 08/27 18:55
抱歉@@有些问题我礼拜一上班完才能回答你...
清洗时是甲醇1ml/min 压力是60-65kgf/cm2左右飘移
跑vit B2流速是1.5ml/min
sample面积都是4XX-6XX
standard面积都是几万到几十万
12F：→ tony15899: 怎麽会看罐标呢 市售商品添加量根本不准是常识 08/27 19:28
我们有个营养师顾问说
营养品的添加量需大於等於罐标,政府才会核准上市
我们也有测过同一支市售产品的vit C是超过罐标的
※ 编辑: xxqoo123 (111.253.179.62), 08/27/2016 21:37:44
13F：→ EmberCelica: 不然试试看标准添加法看看？ 08/27 21:50
抱歉我不知道什麽是标准添加法...之前在食药署的网页只有维生素E的HPLC检验法
14F：推 HPLC: sample 跟 标准品差这麽多 当然可能会负值 08/27 22:12
15F：→ HPLC: 清洗的部分 如果column跟我说的一样 那压力差不多 08/27 22:14
16F：推 HPLC: 你的样品没落在你做的检量线有下面的可能 1.样品含量标示有 08/27 22:22
17F：→ HPLC: 问题 2.你标准品浓度配错 08/27 22:22
请教HPLC大,若是sample有peak出现就代表我的分析是有意义的吧?
因为我主管在怀疑我是不是实验过程误差
才会导致得不到实验的正确值(罐标)
我们天秤是微量天秤可得值到0.0001g,秤重100mg时我会误差10mg左右
这样的误差会太大吗..?
我再去做更低的standard浓度再来跟您确认
18F：→ kdjf: 你的detector是UV/Ri? 08/27 23:21
我确认过後再回覆KD大
19F：推 tony15899: 要确认就直接在样品里加标准品测添加回收率 08/27 23:28
Tony大有更完整的论述可以让我参考吗?小弟不太清楚回收率...
20F：→ o810418: 还有食药署的公告检验方法若有可以参考 08/28 00:22
21F：→ o810418: 你面积是几十万可能是RI? sample的面积太低了 08/28 00:23
22F：→ o810418: 几百在ri几乎都算杂讯等级的程度 你sample是不是有配错 08/28 00:24
23F：→ o810418: 我对uv跟ri的印象若都是一个40mg/5mL左右的东西 08/28 00:25
24F：→ o810418: 面积大概分别3万与几十万的差异 当然厂牌不同应该也有差 08/28 00:25
25F：→ o810418: 但几百对上你标准品几万，应该你SAMPLE问题很大orz 08/28 00:25
食药署我之前翻过只有维生素E的方法...也请教过厂商
厂商说他的方法别人做得出来,我们也要做的出来才对
※ 编辑: xxqoo123 (111.253.172.233), 08/28/2016 09:28:42
※ 编辑: xxqoo123 (111.253.172.233), 08/28/2016 09:32:38
26F：→ HPLC: 你的意思是说 100 mg 你可以秤成110~90 mg? 这其实还满夸张 08/28 15:18
27F：→ HPLC: 的 但只要浓度不要跑 其实无所谓 比如说你浓度要 100 mg/mL 08/28 15:18
28F：→ HPLC: 但你秤成90 mg 那你就加0.9 mL的溶剂溜 这样浓度就是100 mg/ 08/28 15:18
29F：→ HPLC: mL (1 mg/mL =1000 ppm) 08/28 15:18
30F：→ HPLC: 当然 我是主管 我一定不会先觉的仪器有问题 一定是人的误差 08/28 15:23
31F：→ HPLC: 占很大的比例 08/28 15:23
32F：推 good159456: 建议先确认sample 的吸收波长在哪边吧！ 08/28 20:47
33F：推 jeff79723: 请问检量线的配法是怎们配的?中间怎们稀释的?，感觉sta 08/29 11:07
34F：→ jeff79723: ndard 20ppp 面积在几十万有点高。是不是没有稀释好。 08/29 11:07
35F：→ jeff79723: 当然跟单位有关。 08/29 11:07