作者Peetu (さとし)
看板Chemistry
標題[實驗]HPLC mobile phase的peak
時間Tue Jan 22 23:53:57 2013
最近在使用HPLC分析高分子聚合物(polypeptide)
第一次使用HPLC，想請教一個問題
我的column是size exclusion chromatography
mobile phase是PBS
detector是用RI
在進樣前已經有將base line歸零穩定了
然而我的sample進樣後，RT在10分、15分與18分時都會出現peak
打一針空針(only mobile phase)，peak只在15、18分鐘出現
可想而知我的sample應該是在10分鐘出現的那個peak
我的問題是，為什麼15、18分鐘時，會出現訊號呢?
其他人好像都說因為mobile phase本身也會有訊號
但我在進樣前已經將訊號穩定，訊號呈現水平，mobile phase是一樣的
沒道理再打一針mobile phase就會在15、18分鐘出現訊號
打一針純水也會出現一樣的訊號....
但是換了mobile phase後，訊號就不同了
想請問一下，這是什麼原因呢??
謝謝
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◆ From: 140.138.155.68
1F：推 simonmiho:run的mobile phase(MP)跟打進去的MP是同一時間配的嗎? 01/23 03:15
2F：→ simonmiho:如果是的話..會不會是sample loop (手動的話是多向閥) 01/23 03:16
3F：→ simonmiho:那邊會不會髒掉了? 01/23 03:16
4F：→ simonmiho:不過確實SEC的column的solvent front有時候會有訊號~~ 01/23 03:17
5F：→ simonmiho:所以你15/18分鐘會有peak..不過通常peak shape 會不好! 01/23 03:18
打mobile phase是直接從mobile phase取出後直接進樣，同一瓶MP
我進樣是用自動式的，機器會自己洗針
本來也是推測smaple loop髒掉，但是換成不同MP訊號就不同了
所以應該不是污染的問題?!
不同的MP，偵測器(RI)穩定後 打出來也有不同的訊號
peak shape看起來也像一般樣品一樣，高峰狀的@@
所以才想問問看用RI偵測，是不是每次都要先打一針MP，比較peak後才能知道sample
的RT在哪?
謝謝 :)
※ 編輯: Peetu 來自: 140.138.155.68 (01/23 03:41)
6F：推 i19890813:我用的兩台DMF跟THF eluent也都會有MP的峰 01/23 08:00
7F：→ i19890813:就算直接拿MP注入 還是會有但明顯小很多 01/23 08:01
8F：→ i19890813:跟technician討論的結果是 當sample loop進樣時會有一小 01/23 08:03
9F：→ i19890813:段的eluent因為轉動某種原因造成不一樣... 那隻peak不 01/23 08:04
10F：→ i19890813:管怎麼樣都會出現 雖然這結論有點牽強... 01/23 08:05
11F：→ i19890813:你也可以試試把loop purge後直接轉動loop 我的結果還是 01/23 08:09
12F：→ i19890813:會有訊號 01/23 08:10
sample loop在進樣前應該也是充滿了MP，但進様後sample與前端一些MP，一起推入
進去size exclusion column，理論上那些殘餘的MP應該會快速隨著後來的MP流出column
且應該不會有任何(背景)訊號才對?!
因為之前在做FPLC時，打一針MP空針確實是沒有任何訊號的 (用UV)
想說基本原理應該是大致相同
但看了其他人做HPLC實驗，打一針MP好像是要確認MP的peak會落在哪?!
然後當control組 在與sample組做比較
只是還是有點不解 為什麼MP會在固定的RT上出現peak....
雖然我現在HPLC是用RI偵測，但看朋友用UV的，打醇類MP好像也會很多peak...
之前有跟老師討論好像也沒什麼結果 @@
不知道還有沒有其他想法
謝謝回答 :)
※ 編輯: Peetu 來自: 114.43.51.61 (01/23 09:30)
13F：推 HPLC:那是新column嗎? MP是等梯度? 有打三次 都一樣? 01/23 11:49
14F：推 Corsairs:什麼樣的梯度? 01/23 15:45
15F：→ i19890813:我的UV跟RI都會有訊號 但就只有一支 但不影響我的分析 01/23 22:04
16F：→ i19890813:所以就不管它了 01/23 22:04
17F：推 simonmiho:SEC是靠分子量.所以在固定RT會出來...還有RI對溫度 01/24 02:43
18F：→ simonmiho:的改變也算靈敏..不過你是從MP取出後再打..應該也沒差 01/24 02:46
19F：→ simonmiho:一般Water or Agilent的LC autosampler 洗針是只有洗針 01/24 02:49
20F：推 simonmiho:的外表..針的內部要用其他程式或多洗幾次才會乾淨.. 01/24 02:51
21F：→ simonmiho:既然autosampler沒問題的話...就只剩下vial及vial的墊片 01/24 02:52
22F：→ simonmiho:內的東西被MP溶掉後打進去了..雖然這可能性很小... 01/24 02:53
我的MP並沒有拉梯度，已經打過超過三次了，peak都一樣
column 一支新的 一隻是舊的 (串聯使用)，舊的單跑是有peak，新的沒有單跑過
所以不確定是否會出現相同的peak，串聯後與單跑的peak差不多，只是RT有延後
S版友的意思是可能汙染嗎? Vial跟墊片有重複使用，但LAB其他人使用好像就沒這些狀況
column和RI都有恆溫系統在控制，
最近有查一下HPLC的資料，用UV時，選擇solven需要考慮uv cut off的問題，不知道
用RI是否也有需要注意的細節呢?
SEC是靠分子量去分，RT是會在相同地方出來沒錯，
但我的問題是 如果是MP會造成背景值的問題，應該不會在固定的地方有相同強度的訊號?!
謝謝
※ 編輯: Peetu 來自: 140.138.155.68 (01/24 23:47)
※ 編輯: Peetu 來自: 140.138.155.68 (01/24 23:53)