作者Peetu (さとし)
看板Chemistry
标题[实验]HPLC mobile phase的peak
时间Tue Jan 22 23:53:57 2013
最近在使用HPLC分析高分子聚合物(polypeptide)
第一次使用HPLC，想请教一个问题
我的column是size exclusion chromatography
mobile phase是PBS
detector是用RI
在进样前已经有将base line归零稳定了
然而我的sample进样後，RT在10分、15分与18分时都会出现peak
打一针空针(only mobile phase)，peak只在15、18分钟出现
可想而知我的sample应该是在10分钟出现的那个peak
我的问题是，为什麽15、18分钟时，会出现讯号呢?
其他人好像都说因为mobile phase本身也会有讯号
但我在进样前已经将讯号稳定，讯号呈现水平，mobile phase是一样的
没道理再打一针mobile phase就会在15、18分钟出现讯号
打一针纯水也会出现一样的讯号....
但是换了mobile phase後，讯号就不同了
想请问一下，这是什麽原因呢??
谢谢
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◆ From: 140.138.155.68
1F：推 simonmiho:run的mobile phase(MP)跟打进去的MP是同一时间配的吗? 01/23 03:15
2F：→ simonmiho:如果是的话..会不会是sample loop (手动的话是多向阀) 01/23 03:16
3F：→ simonmiho:那边会不会脏掉了? 01/23 03:16
4F：→ simonmiho:不过确实SEC的column的solvent front有时候会有讯号~~ 01/23 03:17
5F：→ simonmiho:所以你15/18分钟会有peak..不过通常peak shape 会不好! 01/23 03:18
打mobile phase是直接从mobile phase取出後直接进样，同一瓶MP
我进样是用自动式的，机器会自己洗针
本来也是推测smaple loop脏掉，但是换成不同MP讯号就不同了
所以应该不是污染的问题?!
不同的MP，侦测器(RI)稳定後 打出来也有不同的讯号
peak shape看起来也像一般样品一样，高峰状的@@
所以才想问问看用RI侦测，是不是每次都要先打一针MP，比较peak後才能知道sample
的RT在哪?
谢谢 :)
※ 编辑: Peetu 来自: 140.138.155.68 (01/23 03:41)
6F：推 i19890813:我用的两台DMF跟THF eluent也都会有MP的峰 01/23 08:00
7F：→ i19890813:就算直接拿MP注入 还是会有但明显小很多 01/23 08:01
8F：→ i19890813:跟technician讨论的结果是 当sample loop进样时会有一小 01/23 08:03
9F：→ i19890813:段的eluent因为转动某种原因造成不一样... 那只peak不 01/23 08:04
10F：→ i19890813:管怎麽样都会出现 虽然这结论有点牵强... 01/23 08:05
11F：→ i19890813:你也可以试试把loop purge後直接转动loop 我的结果还是 01/23 08:09
12F：→ i19890813:会有讯号 01/23 08:10
sample loop在进样前应该也是充满了MP，但进様後sample与前端一些MP，一起推入
进去size exclusion column，理论上那些残余的MP应该会快速随着後来的MP流出column
且应该不会有任何(背景)讯号才对?!
因为之前在做FPLC时，打一针MP空针确实是没有任何讯号的 (用UV)
想说基本原理应该是大致相同
但看了其他人做HPLC实验，打一针MP好像是要确认MP的peak会落在哪?!
然後当control组 在与sample组做比较
只是还是有点不解 为什麽MP会在固定的RT上出现peak....
虽然我现在HPLC是用RI侦测，但看朋友用UV的，打醇类MP好像也会很多peak...
之前有跟老师讨论好像也没什麽结果 @@
不知道还有没有其他想法
谢谢回答 :)
※ 编辑: Peetu 来自: 114.43.51.61 (01/23 09:30)
13F：推 HPLC:那是新column吗? MP是等梯度? 有打三次 都一样? 01/23 11:49
14F：推 Corsairs:什麽样的梯度? 01/23 15:45
15F：→ i19890813:我的UV跟RI都会有讯号 但就只有一支 但不影响我的分析 01/23 22:04
16F：→ i19890813:所以就不管它了 01/23 22:04
17F：推 simonmiho:SEC是靠分子量.所以在固定RT会出来...还有RI对温度 01/24 02:43
18F：→ simonmiho:的改变也算灵敏..不过你是从MP取出後再打..应该也没差 01/24 02:46
19F：→ simonmiho:一般Water or Agilent的LC autosampler 洗针是只有洗针 01/24 02:49
20F：推 simonmiho:的外表..针的内部要用其他程式或多洗几次才会乾净.. 01/24 02:51
21F：→ simonmiho:既然autosampler没问题的话...就只剩下vial及vial的垫片 01/24 02:52
22F：→ simonmiho:内的东西被MP溶掉後打进去了..虽然这可能性很小... 01/24 02:53
我的MP并没有拉梯度，已经打过超过三次了，peak都一样
column 一支新的 一只是旧的 (串联使用)，旧的单跑是有peak，新的没有单跑过
所以不确定是否会出现相同的peak，串联後与单跑的peak差不多，只是RT有延後
S版友的意思是可能污染吗? Vial跟垫片有重复使用，但LAB其他人使用好像就没这些状况
column和RI都有恒温系统在控制，
最近有查一下HPLC的资料，用UV时，选择solven需要考虑uv cut off的问题，不知道
用RI是否也有需要注意的细节呢?
SEC是靠分子量去分，RT是会在相同地方出来没错，
但我的问题是 如果是MP会造成背景值的问题，应该不会在固定的地方有相同强度的讯号?!
谢谢
※ 编辑: Peetu 来自: 140.138.155.68 (01/24 23:47)
※ 编辑: Peetu 来自: 140.138.155.68 (01/24 23:53)