作者soyokenny (soyokenny)
看板Biotech
標題[求救] western blot問題
時間Tue Dec 17 18:56:53 2024
（手機排版 亂掉抱歉）
各位前輩先進大家好
最近在用western blot跑小分子蛋白（17kda)
但band總是跑出奇怪的形狀，如附圖（非常醜請見諒）
https://i.imgur.com/7jeWYfh.jpeg
連internal control (42kda)都出現拖尾的現象，如附圖
https://i.imgur.com/frrTqXF.jpeg
我是使用15% SDS-PAGE 1.5mm
蛋白loading 10到30ug都試過，體積也是試過10ul-30ul
上膠用75v跑到上膠底端，下膠用100v跑到快跳海
Transfer是使用PVDF膜（methanol浸泡1分鐘），100v 90min（塞冰桶，拿出來液體是冰
的）
Blocking用5% BSA室溫兩小時，一抗用BSA照data sheet 1:2000稀釋 4度overnight，二
抗也是照data sheet用BSA 1:2000稀釋，室溫兩小時，Blocking跟染抗的每個步驟中間都
用TBST wash三次，每次五分鐘，最後ECL 1:1配好加1ml壓片。
照上述過程都還是有相同的情況，本來懷疑是我製膠的問題，所以有試過用commercial g
el也是相同情況，懷疑是transfer的問題所以有試過濕式跟半乾式，但也沒有改變。
麻煩各位先進前輩了！謝謝！
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.10.5.157 (臺灣)
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1F：推 maurice9325: 看起來是膠或是蛋白有問題。膠借別人的材料試試看，12/17 20:28
2F：→ maurice9325: 或是請跑出來正常的人幫你配一片膠。另外蛋白質如果12/17 20:28
3F：→ maurice9325: 是直接收沒定量或是組織檢體，建議重複冷凍後多煮幾12/17 20:28
4F：→ maurice9325: 次。12/17 20:28
5F：推 maurice9325: 阿阿，沒看到已經有用其他膠。那marker漂亮嗎，試試12/17 20:30
6F：→ maurice9325: 看從蛋白前處理改善看看。因為從fig 2，可以看到跑12/17 20:30
好的感謝
7F：→ maurice9325: 完膠的結果就很怪了。12/17 20:30
8F：推 Qaaaa: 看起來像樣品沒純化乾淨 很多時候如gDNA沒去掉 大分子會在12/17 21:20
好的，我再試試DNase跟sonication
9F：→ Qaaaa: 跑膠時於上方拉扯而變成這種撕咬感12/17 21:21
10F：→ xxtomnyxx: 42 kDa拖條除了DNA以外，還有可能是下太多蛋白了 12/17 22:03
一開始下10ug的蛋白，但17那條太少了看不到，42還是有拖尾的現象
11F：→ xxtomnyxx: 你的 transfer buffer 配方是什麼？有加SDS嗎？12/17 22:04
我是直接買bio-rad commercial 的transfer buffer來稀釋，沒有加SDS
12F：→ xxtomnyxx: 順便問個你用的跑膠系統是哪個廠牌的？12/17 22:07
跑膠、transfer的機器跟buffer都是用bio-rad的
※ 編輯: soyokenny (123.195.77.180 臺灣), 12/17/2024 23:04:39
13F：推 darrenyo: Marker如果沒歪樣本歪那就是 樣本前處理的問題吧12/18 13:47
14F：推 Renina: 跟廠商要pre casting gel試用品跑一次看看，看起來就是膠12/25 13:22
15F：→ Renina: 的問題12/25 13:22
16F：→ Renina: glycine有沒有受潮呢 12/25 13:22
17F：→ Renina: 其他東西有沒有過期或是混到別的液體，濃度有沒有配錯呢 12/25 13:22
18F：推 jockersung: 已私有可能是鹽類跟dna等等的影響。除了加dnase外，可 12/26 19:15
19F：→ jockersung: 以用cutting column 去掉10k（或是5k 1k的）以下的跑 12/26 19:15
20F：→ jockersung: 看看 12/26 19:15
21F：推 tynse71864: 想問樣品怎麼處理的? 我家也是 biorad commercial全套 12/28 20:54
22F：→ tynse71864: 但偶爾發現樣品很黏稠 (太濃或有 DNA ) 就可能會這 12/28 20:54
23F：→ tynse71864: 樣12/28 20:54
24F：推 nuwoos: 小分子蛋白跑到一半就要停吧。01/03 23:10
※ 編輯: soyokenny (118.169.82.38 臺灣), 02/04/2025 16:29:28