作者migu0531 (migu0531)
看板Biotech
標題[求救] 蛋白定量
時間Fri Jan 26 23:46:53 2018
小妹待的實驗室最近卡在western blot定量的問題，事情是這樣的……
https://i.imgur.com/YAMFUkz.jpg
依照別人留下來的方式，同時用含有目標蛋白的全細胞lysate（冷凍解凍三次的方式破細
胞）和已知濃度的純化蛋白，分
別3倍連續稀釋去做western，再看呈色的條帶粗度比較相應的目標蛋白含量。
用自製的10%膠，蛋白上樣10ul，running buffer是tris-glycine，跑上膠50v 30分鐘，
下膠120v 50分鐘。transfer使用i-blot快速轉漬9分鐘，用市售的t- pro blocking buff
er室溫下搖晃作用1小時，使用的是動物免疫實驗採集的血清作為一抗作用1小時（血清先
用IFA測定力價，western使用則是把測定的力價稀釋到4x IFA。例如力價IFA 2048x >> I
FA 4x，western 用4ml blocking，則加7.8 ul）。二抗AP cong.是市售abcam 抗體稀釋1
000倍，室溫1小時。所有wash步驟都是每次3分鐘，共洗5次。呈色用thermo Bcip/NBT 呈
色時間都不太固定，會視背景和顯色程度，大概都是在3~5分鐘。
但不管我怎麼去調整blocking時間、一抗和
二抗的稀釋倍數，最後呈色都很髒，甚至有一圈一坨的影子。直接用手機拍照。（如圖）
小妹認為直接從動物身上分離的血清會很髒，會有很多干擾。請問還有什麼方式可降低血
清背景干擾?
另外，小妹認為western適合定性，不適合定量，所以有想到用elisa的方式。
想法是這樣……用已知的濃度的純化蛋白和目標蛋白lysate做連續稀釋進行抗原coat
ing，一抗的動物血清使用固定的稀釋倍數，最後用reader讀值。將已知濃度的讀值拉標
準曲線，把未知的讀值去套用，計算出相對的蛋白量。不知道這方式是否可行?
順便問問，不走純化路線的話，還有哪些方式可以進行蛋白定量??
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※ 編輯: migu0531 (101.14.230.143), 01/26/2018 23:50:31
1F：推 joseph103331: ELISA比較適合定量 WB抗體不好還是算了01/27 00:25
2F：推 rasaze: 一圈一圈的這看起來比較像transfer或western 過程不乾淨， 01/27 01:32
3F：→ rasaze: lysate干擾會比較像是很多雜band，不過誠如1樓所說用elisa01/27 01:32
4F：→ rasaze: 定量會好一些01/27 01:32
5F：→ Ianthegood: 你有用保鮮膜？有壓平？01/27 03:21
6F：→ migu0531: 那elisa定量可以用我想的這方式進行嗎？有沒有需要調整01/27 10:59
7F：→ migu0531: 的?01/27 10:59
8F：→ migu0531: Western wash的時間我也有拉長，但如果是transfer的問題 01/27 11:01
9F：→ migu0531: 話，會是什麼? 我都用i-blot快速轉漬。但如果做其他純01/27 11:01
10F：→ migu0531: 化的蛋白就不會有這樣一圈一圈的現象01/27 11:01
11F：推 duriamon: 其實你這個方法已經足夠了，問題是你的轉印後的某個步驟 01/27 14:24
12F：→ duriamon: 有很大瑕疵，你如果是底片呈色最好在暗房確定是不是蛋白 01/27 14:24
13F：→ duriamon: 質太多或呈色劑太強，有時候太強你會看到呈色劑被催化太 01/27 14:24
14F：→ duriamon: 快，在塑膠片跟底片之間一邊擴散一邊發光。ELISA其實不 01/27 14:24
15F：→ duriamon: 會比較好，只是眼不見為淨，你要用ELISA最好要用sandwic01/27 14:24
16F：→ duriamon: h的方式，也就是需要兩個抗體分別抓你要檢測之蛋白質的01/27 14:24
17F：→ duriamon: 不同端，要不然誤差比你現在的方式還大。01/27 14:24
18F：推 duriamon: 上面不小心打錯，是塑膠片跟膜之間。你可以把膜放到裝有01/27 14:33
19F：→ duriamon: 呈色劑的盒子內搖一搖，然後用鎳子夾起來讓膜上的液體稍01/27 14:33
20F：→ duriamon: 微滴乾再壓片試試。通常在暗房壓片不要急著用底片呈色，01/27 14:33
21F：→ duriamon: 應該要先觀察冷光強度，如果肉眼都能很明顯看到，那通常 01/27 14:33
22F：→ duriamon: 代表冷光太強了，要再重新調整。01/27 14:33
23F：推 duriamon: 至於妳說的“直接從動物身上分離的血清會很雜，會有很多01/27 14:39
24F：→ duriamon: 背景干擾。”其實是不存在的。因為你做的是western-blot 01/27 14:39
25F：→ duriamon: ，由於轉印前面是電泳的關係，你所謂的背景怎麼可能會一01/27 14:39
26F：→ duriamon: 圈一圈的出現在膜上呢？01/27 14:39
27F：→ Ianthegood: 加完ecl後 滴乾 背面跟角落用擦手紙吸乾 再準備壓 保01/27 17:59
28F：→ Ianthegood: 險膜/塑膠片用滾輪滾過確保沒有空隙01/27 17:59
29F：→ Ianthegood: 你的圖有掃過處理過吧 看不太出來原本的intensity 那01/27 18:03
30F：→ Ianthegood: 個pattern也有可能是membrane/底片老化或潮到 可以壓 01/27 18:03
31F：→ Ianthegood: 張白片做control01/27 18:03
32F：→ migu0531: 我不是用壓片的方式~01/27 23:24
33F：→ migu0531: 背景有兩的問題，一個是出現一圈或是一坨的，另一個是 01/27 23:26
34F：→ migu0531: 整張membrane背景容易黑掉 01/27 23:26
36F：→ migu0531: 會像這圖一樣，連我的marker，和目標條帶都快跟北京融 01/27 23:30
37F：→ migu0531: 為一體了！01/27 23:30
38F：→ migu0531: 背景01/27 23:30
39F：推 duriamon: 說實在…妳自己不講清楚沒人知道妳再幹嘛，我想應該沒人01/27 23:40
40F：→ duriamon: 喜歡玩這種猜謎遊戲吧…。01/27 23:40
41F：推 duriamon: 另外妳目前這種古早呈色方式…我看問題是蠻大的…跟要不01/27 23:46
42F：→ duriamon: 要換ELISA恐怕是沒什麼關聯。01/27 23:46
43F：推 joseph103331: 想問為什麼動物分離的血清背景會很髒這件事情是不 01/28 01:00
44F：→ joseph103331: 存在的，因為是做WB? 我這邊就有好多是很髒的血清.01/28 01:00
45F：→ joseph103331: ...01/28 01:00
46F：推 duriamon: 建議樓上可以再把我之前打的回覆多看幾次，然後想一想我 01/28 05:20
47F：→ duriamon: 在講甚麼。01/28 05:20
48F：推 joseph103331: 如果是說血清雜的話,背景應該要有一條一條的雜訊01/28 22:25
49F：→ joseph103331: 我也遇過血清會辨認membrane,結果整片黑,跟電泳無關01/28 22:25
50F：→ joseph103331: 直接拿membrane去做背景就髒了01/28 22:26
51F：推 joseph103331: 這種情況要調整blocking reagent,但也不保證成功01/28 22:33
52F：→ joseph103331: Western可變因子太多,在有純化蛋白質的條件下,我覺 01/28 22:34
53F：→ joseph103331: 得改成ELISA可能會較好,但要注意cell lysate的影響01/28 22:34
54F：推 duriamon: 其實我並不懷疑血清會影響蛋白質條帶的背景訊號，但老實01/29 10:34
55F：→ duriamon: 說要如何解釋並說服人“血清會辨認轉印膜這種事”？身為 01/29 10:34
56F：→ duriamon: 科學家如果不能用邏輯思維做實驗並推論，那跟去廟裡求神 01/29 10:34
57F：→ duriamon: 問佛有什麼差別？樣品為何要跑電泳不就是為了將蛋白質有 01/29 10:34
58F：→ duriamon: 方向有規則的分離開，一旦完成電泳蛋白質在膠體的位置就 01/29 10:34
59F：→ duriamon: 暫時固定，除非你放太久產生擴散要不然轉印後的位置就應01/29 10:34
60F：→ duriamon: 該與電泳的位置相同。蛋白質轉印後有沒有機會從轉印膜跑01/29 10:34
61F：→ duriamon: 下來結合到非條帶的區域？是有機會的，一種是你轉印過久01/29 10:34
62F：→ duriamon: 蛋白質穿過轉印膜經擴散或是濕式轉印攪拌時黏上去。另一01/29 10:34
63F：→ duriamon: 種是你樣品中的蛋白質過量，超過轉印膜的capacity，多的01/29 10:34
64F：→ duriamon: 蛋白質就雖轉印液到處黏。總之這都是不正常的狀況，蛋白01/29 10:34
65F：→ duriamon: 質下多少、轉印跑多久、轉印膜的材質、轉印液有無重複使 01/29 10:34
66F：→ duriamon: 用都是可評估的。01/29 10:34
67F：推 joseph103331: 你仔細想想為什麼要做blocking,就知道血清為什麼結01/30 19:41
68F：→ joseph103331: 合membrane了,這類訊號用glycine是可以沖提的 01/30 19:42
69F：→ joseph103331: 其實原PO要做的事情很簡單,一沒有要觀察片段大小,二01/30 19:45
70F：→ joseph103331: 來擁有標準品,是兩種WB跟ELISA都合適的條件01/30 19:45
71F：→ joseph103331: 選擇可變因子小的方法做調整,會比較理想01/30 19:46
72F：→ migu0531: J大說的用glycine沖提是什麼意思?01/30 20:58
73F：推 joseph103331: 用pH3.0的glycine可以沖下membrane上的蛋白質結合01/30 22:18
74F：→ joseph103331: 有些人使用coating在膜上的蛋白質來純化抗體會用 01/30 22:18
75F：推 duriamon: 你轉印的時候會用pH 3的glycine?我是不知道你的實驗目的01/31 10:40
76F：→ duriamon: 是什麼。但你不覺得這跟正常的western-blot步驟還有這個01/31 10:40
77F：→ duriamon: 主題沒有關聯嗎？另外一提正常用來blocking的溶液pH也不 01/31 10:40
78F：→ duriamon: 會是酸性的，你如果說要做stripping我還會信。其實本討 01/31 10:40
79F：→ duriamon: 論的問題點我早就回覆了，去爭論這些沒什麼意義，至於你 01/31 10:40
80F：→ duriamon: 要相信什麼我也無法影響你。 01/31 10:40
81F：→ migu0531: 希望這討論別引起戰爭。 我相信血清對上沒有純化的蛋白01/31 12:27
82F：→ migu0531: ，背景會髒這件事，以前老師是這樣跟我們說。但現在實01/31 12:27
83F：→ migu0531: 驗室認為是我操作的問題，所以上來尋求其他方式01/31 12:27
84F：推 ararthur: 血清容易不乾淨+1 通常是大量的IgG.albumin的干擾 可以01/31 12:41
85F：→ ararthur: 找到相應的去除方式 甚至kit 另外妳不是用壓片的方式是01/31 12:42
86F：→ ararthur: 指... 妳用照相儀器偵測? 還是直接染membrane? 我其實看01/31 12:43
87F：→ ararthur: 不太出來 可以請妳說詳細一些嗎 01/31 12:43
88F：→ ararthur: 這一圈一圈的髒汙 卻沒有影響到band 我判斷不是running01/31 12:44
89F：→ ararthur: 或transfer的問題 可能是membrane本身品質 或染抗體不勻01/31 12:45
90F：→ ararthur: 所導致 01/31 12:45
91F：→ blence: 原po應該不知道問題在原本內容交代不清,推文只能用猜謎01/31 13:02
92F：→ blence: 要從WB改變成ELISA,我認為至少先確認問題是WB技術瓶頸,而01/31 13:02
93F：→ blence: 不是人為因素改變策略才有必要,畢竟ELISA怎說一定順遂呢?01/31 13:03
94F：→ blence: 推文說不是壓片,但兩張連結不像是照相,我有誤會嗎？01/31 13:06
95F：→ Ianthegood: 那個一看就不是抗體的問題01/31 18:32
96F：推 Ianthegood: 再者如果你覺得是抗體不好 你完全無法確認elisa的訊 01/31 18:35
97F：→ Ianthegood: 號是你的protein01/31 18:35
※ 編輯: migu0531 (101.12.146.105), 01/31/2018 19:20:29
※ 編輯: migu0531 (101.12.146.105), 01/31/2018 19:20:53
98F：→ migu0531: 是用手機照相的 01/31 19:22
99F：→ migu0531: 另外，只有在做這全蛋白的western才會有這樣的現象。其 01/31 19:59
100F：→ migu0531: 他純化的蛋白用市售的抗體則不會這樣 01/31 19:59
101F：→ blence: 你看推文應該會覺得不少人誤解呈色方法,那時就該介入澄清 01/31 20:06
102F：推 duriamon: 她自己可能也不了解自己的實驗在做什麼，或跟其他實驗室 01/31 20:45
103F：→ duriamon: 有什麼不同，但我猜這照片應該不是最常被使用的冷光底片 01/31 20:45
104F：→ duriamon: 呈色，而是用NBT 之類的試劑直接在膜上呈色，所以照片裡 01/31 20:45
105F：→ duriamon: 的圖才不像是底片透明的，那些一坨一坨的背景是色素沉澱 01/31 20:45
106F：→ duriamon: 在膜上。 01/31 20:45
107F：推 duriamon: 我回覆完才看到原po修改的內容了，剛樓上打的就當作是多 01/31 20:55
108F：→ duriamon: 餘的吧。 01/31 20:55
109F：推 duriamon: 妳打清楚後答案就很明顯了。問題很有可能來自你使用的一 01/31 21:05
110F：→ duriamon: 抗是自製的動物血清，還有你用的blocking試劑。簡單來說 01/31 21:05
111F：→ duriamon: 一抗最好越純越好(用自製的以後發表時麻煩會多許多)，而 01/31 21:05
112F：→ duriamon: blocking試劑不是用commercial就一定沒問題。當然NBT這 01/31 21:05
113F：→ duriamon: 個方法背景值比冷光呈色高也可能使你的問題更嚴重。 01/31 21:05
114F：推 joseph103331: 只能說抗體不好, 做什麼都不會順遂.... 01/31 22:37
115F：→ joseph103331: 若是時間財力允許, 進一步純化抗體會比較好 01/31 22:37
116F：→ tz2733: 建議換呈色方法 02/01 00:19
117F：→ tz2733: 改用冷光呈色(CDP-STAR之類) 然後再來修正blocking 抗 02/01 00:36
118F：→ tz2733: 體等條件 我會先選擇1抗改成4度C 搖o/n 再來修正blocking 02/01 00:36
119F：→ tz2733: buffer(濃度 種類) 都不行我就會說1抗不優不好用T.T 02/01 00:36