作者sunnyandsund (sunny)
看板Biotech
標題[求救] western blot壓出空白片
時間Sat Jan 20 23:53:33 2018
我最近在做western blot
我大學到研究所期間都做過western blot
都有做出結果
現在到其他實驗室做WB卻做不出來
實驗室的人幾乎都做過WB
只是不是在這間實驗室做的
是在其他實驗室做的
所以東西藥品是舊的
細胞蛋白抽取後測完濃度冰到-80
然後加6X sample buffer煮5分鐘
loading到10% SDS PAGE上膠80V 下膠120V
marker有分開
transfer buffer 是用tris和glycine也有加20% methanol和0.4% SDS
transfer用biorad 的tank 條件是300mA 1.5hr
轉到NC membrane上
marker每條都有轉過去
然後因為之前第一次做的時候也是都空白片
所以這次有用ponceus S染膜
卻沒染出任何東西
我們沒有染膠 因為沒有comasin blue
然後就5% milk blocking
一抗目標抗體1:1000 overnight 二抗anti-mouse 1:5000
暗房壓片 ECL作用3分鐘 壓片5分鐘 底片超乾淨 沒東西
strip後 blocking 1hr
1Ab anti-bactin 1:5000 overnight 4度C
2ab anti-mouse 1:5000 1hr RT
TBST wash 三次 十分鐘後
暗房壓片 ECL作用3分鐘 壓片10分鐘
底片很乾淨沒東西
想問這是什麼問題?
還有因為我以前都是用PVDF膜
但這裡是用NC的
我的transfer條件是用以前的方式
想問NC的transfer 條件是?
就是關於時間和安培的部分
謝謝
我真的做到快崩潰
希望大家解救阿
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1F：→ milulittle: 奶粉是好的嗎 01/21 01:35
2F：→ e104582001: NC用法很不一樣... 01/21 01:50
3F：→ aj1139: 我跟你的方法幾乎完全一樣 01/21 08:24
4F：→ aj1139: 換成PVDF就好了 01/21 08:24
6F：→ aj1139: Q18Nv 01/21 08:33
8F：推 aj1139: 我目前的lab也是NC membrane做不出來，雖然我自己覺得這 01/21 08:35
9F：→ aj1139: 東西沒有過期的問題，但由於我同樣的做法換成PVDF就做出 01/21 08:35
10F：→ aj1139: 來了，實在讓我不得不懷疑NC 01/21 08:35
11F：→ turtle24: ponceus S沒染到東西，會不會是定量或稀釋的問題 01/21 08:58
12F：→ ender: 我是這篇的原PO,因為我的帳號暫時不能回,我先借別人的回 01/21 13:35
13F：→ ender: M大 我的牛奶是新買的,應該是沒問題.E大想請問NC用法不同, 01/21 13:36
14F：→ ender: 是指哪方面不同?那他transfer的條件是? 01/21 13:37
15F：→ ender: A大 我們目前可能不太能換成PVDF阿 01/21 13:38
16F：→ ender: 想請問為何ponceus S沒染到會是蛋白稀釋和測濃度的問題? 01/21 13:39
17F：推 joseph103331: NC有點脆弱不太能strip,ponceus S沒染到東西很怪 01/21 16:46
18F：推 ABULA666: 好奇如果你現在待的實驗室是用NC片，有參考先前的操作方 01/21 22:41
19F：→ ABULA666: 法嗎？如果沒有，你寫的步驟從何處參考？不過除了這些， 01/21 22:42
20F：→ ABULA666: 用Ponceus S染膠沒染出東西問題更大，應該是前處理樣本 01/21 22:43
21F：→ ABULA666: 就有問題。 01/21 22:43
22F：→ aj1139: 如果你人在台北，我借你PVDF跟comassie blue做troublesho 01/22 07:46
23F：→ aj1139: oting如何？有需要請私 01/22 07:46
24F：推 pent: gel 上有東西嘛？ 01/22 16:14
25F：→ blence: NC有看到marker,ponceus S沒染到band,先去關心有無蛋白 01/22 17:16
26F：推 TAKONA: 我實驗室用GE NC膜, transfer 300mA 2 hr 01/23 03:18
27F：推 exosome: Transfer 時取消 0.4% SDS 試試 03/03 13:37