作者patricksky (江伯)
看板Biotech
標題[求救] 切膠純化後DNA再次跑膠卡在well中
時間Thu Jan 18 16:41:55 2018
各位好,
最近發現PCR產物(200bp多)切膠後，再次跑膠發現產物不見了，
並且似乎卡在 gel well上，有smearing DNA痕跡
https://i.imgur.com/aFQ96yL.jpg
但是positvie control DNA 同樣切膠純化後，DNA產物再次跑膠是沒問題。
實驗做了三次，後兩次純化步驟有換新buffer，但是三次產物切膠後都不見了，
產物似乎都卡在gel well裡面，但是positvie control三次實驗同樣沒問題。
檢體PCR產物量比control少，產物亮度介於100和500bp亮度中間，不算多也不算少，
同時檢體有很多其他bands，control是一條band
檢體是病人血液 DNA，positive control是健康人血液 DNA
因為positive control沒問題，所以我認為PCR和切膠純化步驟本身沒有問題，
是否是檢體本身造成的影響?
以下是其他資訊
1. 使用Bioman EasyPure PCR Clean up/Gel extraction Kit
2. 因有人共用此產品，buffer 會分管使用，有換過新分管buffer
3. 依據使用說明書，純化步驟有改兩個地方，
我用2% Gel，所以binding buffer多一倍
很久之前有發現DNA會不純，所以wash buffer再多洗一次
4. Elution step 用過ddH2O和 Elution buffer，狀況都一樣，
擔心是汙染造成DNA degradation，所以 ddH2O和Elution buffer都有換過。
另外擔心可能DNA殘留在column上，有多通一次Elution step，
結果第二管去跑膠和 nanodrop 檢測都沒有DNA。
5. DNA 有可能自己亂組合，有95度C 煮10分鐘後自然冷卻，但是沒有改善。
6. 考慮到個人實驗操作的影響，有請另一人幫忙單獨做一次，結果還是一樣慘。
而且positive control 沒問題。
7. 這實驗在上禮拜做其他病人檢體沒問題，有拿上禮拜不同病人的舊檢體再做一次，
舊檢體沒問題。
還有可能是哪邊出問題?
PCR結果雖然不是單一產物，但是畢竟主要的產物還在，
控制組也沒問題，所以PCR有問題的嫌疑很小。
總覺得還是純化kit嫌疑最大，但是控制組和舊檢體又可以做成功。
最後要回歸到這次檢體本身身上?
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1F：推 joseph103331: 有沒可能DNA根本沒到column上面? 01/18 22:32
感謝提醒,我跑看看過column後的DNA是否還在
2F：→ blence: 如果260/280在範圍內,測得濃度對比control符合PCR產物亮度 01/18 23:04
3F：→ blence: 我會試著往下做;感覺只是有"東西"影響gelling,產物還是在 01/18 23:04
感謝,我會回頭測看看,往下做是要定序,嘗試後發現定序很差或失敗
※ 編輯: patricksky (49.159.106.6), 01/18/2018 23:50:35
4F：→ ernielwl: 有沒有切膠的gel前後對照的圖?我覺得PCR產物可能有問題 01/19 02:09
5F：→ ernielwl: 畢竟變因就差在檢體不同 01/19 02:11
切膠沒問題
後來回頭測DNA後，發現這批純化的PCR DNA quality都特別差...
應該是某些東西抓在DNA上...可能要多洗幾次column了
※ 編輯: patricksky (220.136.109.82), 01/19/2018 16:00:15
6F：→ milkpa: 有沒有第一次跑膠的照片 01/19 17:51
7F：→ blence: 怕改了操作後定序是不是失敗,可以先拿產物再上一次PCR試試 01/20 04:20