作者ccjwo (靘~BI單身日記)
看板Biotech
標題[求救] PCR的band消失了
時間Mon Sep 25 13:38:06 2017
小弟正在利用PCR和Rsa I digestion的方式進行db/db mice的genotyping，
以下為primer與PCR條件
Rsa I-F (5’-AGAACGGACACTCTTTGAAGTCTC-3’)
Rsa I-R (5’-CATTCAAACCATAGTTTAGGTTTGTGT-3’).
94℃for 1 min,
55℃for 1 min,
72℃for 1 min for 40 cycles.
一開始兩個月都沒問題，但卻突然在兩個星期前開始P不出任何band了，
primer重訂、polymerase重買，同樣的PCR reaction在另一組lepr全長的primers做為con
trol
有p出正確的band但利用新訂的Rsa I primer卻p不出任何band，
想請問版大門是否有逾過相同的問題，或是有什麼提議能解決這個問題?
感謝大家。
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狠多東西需要證明的原因..
不是因為被相信..而是因為被懷疑..
如果你深信不疑..那又何必去證明呢??
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.113.239.150
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1F：→ turtle24: 舊的gDNA有試過嗎？09/25 14:44
2F：→ turtle24: 抽gDNA的試劑同一批？09/25 14:46
3F：→ ccjwo: 有利用之前成功過的舊gDNA當contorl，Rsa l primer一樣p不09/25 14:55
4F：→ ccjwo: 出來，Lepr全長的primer就p的出來，抽gDNA的kit是不同組但09/25 14:55
5F：→ ccjwo: 跑gel是有抽到gel上有band。09/25 14:55
※ 編輯: ccjwo (114.137.92.7), 09/25/2017 14:57:17
6F：推 joseph103331: 該不會機器出毛病吧…去其他家借一下機器，或是微09/25 15:26
7F：→ joseph103331: 調一下annealing的溫度如何？09/25 15:26
8F：→ ccjwo: 同一台機器同一組條件,lepr有p成功但Rsa I 沒有band,試過三09/25 17:39
9F：→ ccjwo: 種溫度50...52...55...結果都一樣...09/25 17:39
10F：推 HateRoach: Buffer有沒有換過阿09/25 22:15
11F：→ ccjwo: 有...整個polymerase都買新的了...09/25 22:28
※ 編輯: ccjwo (114.137.92.7), 09/25/2017 23:39:43
12F：推 Ianthegood: 同樣的polymerase? buffer跟dNTP有換嗎 09/26 00:34
13F：→ ccjwo: 同樣的polymerase所以用新的同牌buffer,我有用兩種不同牌 09/26 17:33
14F：→ ccjwo: 的dNTP進行PCR,一樣只有lepr primer control有成功, Rsa I 09/26 17:33
15F：→ ccjwo: primer一樣沒有band 09/26 17:33
16F：推 ernielwl: 哪家廠商做的primer.該不會做錯了 09/27 00:33
17F：推 joseph103331: Rsa片段是lepr的其中一段嗎？不然把p出來的lepr拿 09/27 03:02
18F：→ joseph103331: 去定序，再回來對Rsa primer看現在訂的能不能黏上 09/27 03:02
19F：→ joseph103331: 去？ 09/27 03:02
20F：→ blence: 文中提到用lepr全長的primer,應該不是lepr基因全長吧? 09/27 22:11
21F：→ blence: 原po好像能換都換,也都有對照,或許不是PCR反應的問題? 09/27 22:16
22F：→ blence: 例如這類PCR-RFLP需要創造切位,往往產物小,影響跑膠觀察 09/27 22:20
23F：→ ccjwo: 不是，我的意思是能夠p出lepr全長的control primer...是用 09/28 10:32
24F：→ ccjwo: 來確定整個PCR reaction並沒有問題...而Rsa l primer能p出 09/28 10:32
25F：→ ccjwo: 的長度為135 bp...在3% gel上可狠明顯的看到...接著我們再 09/28 10:32
26F：→ ccjwo: 利用Rsa l進行digestion...wt會得到135 bp的band...+/-有三 09/28 10:32
27F：→ ccjwo: 個band...-/-有兩個band... 09/28 10:32
28F：→ turtle24: PCR機器最近有沒有做保養或檢測，我有遇過溫度不準的 09/28 23:56
29F：→ turtle24: 放正中間會p不出來的那種… 09/28 23:57
30F：推 joseph103331: 試劑都沒有問題那就回到條件上面囉，從機器、溫度 09/29 00:59
31F：→ joseph103331: 跟primer方面著手吧，重新設計primer是否可行？ 09/29 00:59
32F：推 csmceddie: 135bp 72度 1分鐘太久了吧 09/29 01:50
33F：推 csmceddie: 我猜你的data應該不是完全沒夾到東西 09/29 01:52
34F：→ csmceddie: 而是smear 所以看不到major band是嗎？ 09/29 01:53