作者kaofei (phoebe)
看板Biotech
標題[閒聊] 如果Poly A tail沒有以A作結
時間Mon Sep 18 21:01:07 2017
想請問
就如果以人為的方式轉出mRNA，通常會在3'端幫他做個poly A tail
假使當初把gene clone進plasmid，但沒有設計好限制酶切位
早成產物切下來後還會帶有一段限制酶切位在poly A tail之後
如下方
T7-ATGXXXXXX.........TAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTACC
這會影響到mRNA的功能嗎？
謝謝~~
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1F：→ ernielwl: 才疏學淺.....第一次看到人工加poly a 09/18 21:10
2F：→ ernielwl: 如果要表現成protein，只要你的cds完整就可以了 09/18 21:11
3F：→ ernielwl: 轉譯做到stop codon就會停了不是嗎 09/18 21:12
4F：→ kaofei: 用primer induce poly A不行嗎@@？我看paper是這樣弄得... 09/18 23:06
5F：→ kaofei: 我印象中poly A是用來保護mRNA的，但不確定會不會影響轉譯 09/18 23:10
6F：推 eric2853: 我也是第一次看到自己加polyA的... 09/19 00:38
7F：→ Ianthegood: 看你的mRNA想幹嘛啊 09/19 02:26
8F：→ Ice9: 你看過plasmid map 嗎？在MCS後面通常會有poly-A signal，不 09/19 07:58
9F：→ Ice9: 需要人工加上A尾。而且，你加上去，它也是被當作3'UTR一部分 09/19 08:00
10F：→ Ice9: 會黏上什麼東西，不知道。 09/19 08:00
11F：→ kaofei: 想用來做transient expression of the targed protein 09/19 09:06
12F：推 leptoneta: 這是好問題 可以研究看看 09/19 11:06
13F：推 qiet: 要不要先check你的plasmid有沒有polyA阿 通常都有耶 09/19 11:38
14F：→ blence: 如果原po用T7來表現,是沒有polyA的,我剛看pRSET,pET45就是 09/19 13:10
15F：→ blence: 就算是一般vector用的SV40 polyA,也不會是全都A 09/19 13:16
16F：→ a90648: 原PO的T7感覺是in vitro transcription時用的 09/19 13:46
17F：→ a90648: 接進去的plasmid不知道是哪個promoter 09/19 13:47
18F：→ a90648: 不過已經做過in vitro transcription了，從那個plasmid 09/19 13:48
19F：→ a90648: 切下來接到要用的expression plasmid就好啦 09/19 13:49
20F：推 Ianthegood: 他要ivt出rna再電進細胞啦 如果是這樣我覺得那幾個bas 09/19 20:13
21F：→ Ianthegood: e會有差 09/19 20:13
22F：→ Ice9: 抱歉，眼殘沒見到T7在前。 09/19 21:36
23F：→ kaofei: 想請問樓樓上會有差是因為甚麼呢? 3'UTR太長或序列錯嗎 >< 09/20 12:37
24F：推 Ianthegood: 我覺得電進去後的stability會很糟 09/20 15:03
25F：推 qiet: 同上沒看到T7, 是我就會重做, 不希望有這種不確定因素 09/22 20:01
26F：→ qiet: 避免因此使後面troubleshooting疑神疑鬼的 09/22 20:02
27F：→ Ice9: 忽然想到，因為mRNA是裸露的，所以後面多幾個其他bases可能 09/23 08:35
28F：→ Ice9: 沒有差別，進去要不是做幾個蛋白出來，就是馬上被消滅。重點 09/23 08:36
29F：→ Ice9: 可能還是在RNA品質等其他因素上。另外，記得以前看過 poly-G 09/23 08:37
30F：→ Ice9: 在細菌有較長的half-life，但不知道在細胞株中是否也是。 09/23 08:38
31F：→ xxtomnyxx: 樓上，mRNA可不是裸露的阿.... polyA tail 就是讓 PABP 09/24 04:25
32F：→ xxtomnyxx: 黏上去，以減緩 RNase 從 3' 端快速降解掉 mRNA 09/24 04:26
33F：→ Ice9: 它送進去就是裸的啊。送進細胞去，就看是PABP先靠上去還是 09/24 18:40
34F：→ Ice9: exonuclease先解決它。 09/24 18:41
35F：→ kaofei: 謝謝大家提供的意見XD 我看到paper上polyA後面會接的RE 09/24 22:16
36F：→ kaofei: 切位包括BamHI跟NotI，前者會留一個T，後者留GC，看來是可 09/24 22:16
37F：→ kaofei: 行的，但我自己的會多4個bp，所以就很好奇這影響會有多大 09/24 22:17