作者chan50515 (姆哈哈～)
看板Biotech
標題[求救] PCR產物大小錯誤，但質體構建成功
時間Tue Aug 22 20:14:51 2017
大家好，最近實驗遇到一個問題
先簡述實驗內容：
1. PCR vector and insert
2. Digest with enzyme
3. Ligation
第一步驟PCR完大小是錯誤的
預期vector大小約為4.9k bp (原始質體大小5.9k bp)
但agarose gel結果顯示卻不是如此 (如附圖)
http://imgur.com/9k2QSmi
但由於PCR結果十分專一，因此我還是回收後做酶切
大小一樣比預期中的大 (如圖)
http://imgur.com/5ODd62M
雖然大小未跟預期的相同
我仍然繼續往下做vector and insert ligation
最後轉化及驗證結果
是以colony PCR insert及酶切2刀確認質體大小
皆為我要的質體 (構建成功)
想問問大家是否有遇過這種狀況?
以下為我PCR的所設定的program
94C, 5 min
94C, 40 s ----
55C, 30 s |-30 cycles
72C, 3 min ----
72C, 10 min
第一次遇到這種狀況
想請問有沒有人知道原因？
謝謝!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.116.168.31
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1503404096.A.AE8.html
※ 編輯: chan50515 (140.116.168.31), 08/22/2017 20:18:42
1F：推 Bows: vector 用PCR?沒定序過什麼都是假的 08/22 21:38
2F：→ rasaze: 就像一樓說的定序完再來說成功 08/22 22:06
好的 謝謝!
3F：→ Ianthegood: polymerase跟膠系統都沒講啊 08/22 22:18
PCR是使用Ex-Taq
4F：→ Ianthegood: 你insert如果有做對 colony批跟切當然都會是對的size 08/22 22:20
5F：→ Ianthegood: 啊 08/22 22:20
6F：→ Ianthegood: 不止要定序 你還得把整個vector都定完 08/22 22:21
好的! 謝謝你的提醒
7F：→ blence: Vector要PCR大概是沒RE切點,不過放30cycle太多,容易有突變 08/22 22:24
是的，因為vector與insert沒有相同切點
所以皆須PCR
8F：→ blence: 假使沒切位,使用驗證方法有辦法排除5.9k的污染嗎？ 08/22 22:24
9F：→ blence: 至於產物偏高,使用safe-dye內染的操作是有可能出現的 08/22 22:26
10F：→ aj1139: 同以上各樓，先定序確認再做吧 08/22 22:26
好 了解了 謝謝各位
※ 編輯: chan50515 (140.116.168.31), 08/22/2017 22:40:35
11F：推 joseph103331: 原始大小5.9k 產物5.9k,是把原質體的insert一起做出 08/23 00:56
12F：→ joseph103331: 來啦? 08/23 00:56
13F：→ Ice9: 我個人其實不太建議原PO在非得使用這個 vector 的情況下這麼 08/24 01:23
14F：→ Ice9: 做。我的做法會是 vector 切一切，補平，insert 平塞。之後 08/24 01:25
15F：→ Ice9: 長出來的，再用 PCR 或 RE 先確定順序，再送定序。 08/24 01:28
16F：→ Ice9: 如果 insert 也是切出來的，那更好了。先將 V/I 切切純化， 08/24 01:29
17F：→ Ice9: 再設計引子把 V/I 連接後整個 PCR 出來，純化、餵菌、定序。 08/24 01:31
18F：→ Ice9: 而後者的 PCR 酵表，建議用高規格的。此時通常只定序看切位 08/24 01:32
19F：→ Ice9: 唔，趕在被打臉之前改一下我的建議做法： 08/24 20:10
20F：→ Ice9: 先將 Insert PCR 出來純化，引子用含有一部分 vertor 插入位 08/24 20:11
21F：→ Ice9: 附近的序列。然後以之前的insert為 primer 去對vertor做PCR 08/24 20:12
22F：→ blence: 上面提到的應該就是two-step site-directed mutagenesis 08/24 21:14
24F：→ blence: 文中提到可以1k,我自己<2k都沒問題,但3k以上就沒成功過 08/24 21:15
25F：→ blence: 原po的方法還是有遇到的機會,不過我比較偏好重新創造MCS 08/24 21:17
26F：→ Ice9: 我手上做過的 insert，確實沒有超過 2K 過。 08/28 16:14
27F：推 boblu: 喜歡自己做 cloning site +1 09/07 04:56
28F：→ satasumi: 換一家MARKER對照看看 06/23 16:33